细胞工程

细胞工程Cellengineering基本概念•细胞工程（cellengineering）:应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养，和/或获得细胞产品的一门综合科学技术。研究内容•根据研究对象不同：•动物细胞工程：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术(核移植、胚胎分割等)；克隆技术(单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆)。•植物细胞工程：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。•按照需要改造的遗传物质不同操作层次:•染色体工程：按人们需要来添加或削减一种生物的染色体，或用别的生物的染色体来替换。•染色体组工程：整个改变染色体组数的技术。•细胞质工程(细胞拆合工程)：通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。•细胞融合工程：用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。第一章细胞培养设施与基本条件第一节实验室设置第二节细胞培养实验室设备器材第三节清洗、包装、清毒第四节培养用液第五节其他培养用液第一节实验室设置•无菌操作区：更衣间、缓冲间、无菌操作间•孵育区•制备区•储藏区•清洗和消毒灭菌区第二节细胞培养实验室设备器材CO2培养箱过滤装置高压灭菌锅冰箱第三节清洗、包装、清毒•玻璃器皿类•橡皮帽和橡皮塞的清洗•塑料制品的清洗•金属器械第四节培养用液•平衡盐溶液(BSS)：Ringer、Earle•组织培养基：天然培养基、合成培养基(无血清培养基、无蛋白培养基(PFM)和限定化学成分培养基(CDM)）血清主要作用：1)提供基本营养物质2)提供贴壁和扩展因子3)提供激素及各种生长因子4)提供结合蛋白5)对培养中的细胞提供某些保护作用蛋白质血清的主要成分，细胞代谢所需；促进细胞贴壁、分化和增殖；增加培养基的成泡性，在吹打和搅拌时可减少切力；增加培养基的缓冲力。生长因子细胞生长的主要促进因子，增加有丝分裂原的活性和稳定性。激素胰岛素可促进细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取，生长激素与促生长因子的结合可具有有丝分裂原的效果，促进细胞的附着、分化和增殖。抑制物血清中可能含有抑制细胞增殖的物质，热灭活可去除一些不稳定的成分，特殊培养时需要进一步处理。使用含血清培养液的缺点：生理变化：血清中含有大量微量成分，其含量和作用还没有完全确定。储藏寿命和稳定性：每批血清都不同。质量控制：不同批次间难以保持一致。特异性：同一批血清对不同种类的细胞有一定的差异性。可利用率：可利用动物数量和质量的限制。后期加工：生长抑制剂：污染、价格和标准化：配制培养基注意问题：1）NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等2）配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要在培养基完全溶解之后才能添加。3）配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4℃。•消化液：胰酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液•pH调整液：HEPES液、NaHCO3溶液•谷氨酰胺补充液•抗生素液第五节其他培养用液BSS三个功效：（1）作为稀释和灌注的液体（2）提供缓冲系统（3）提供正常细胞代谢所需的水分和无机离子（1）青、链霉素（双抗液）作用：青霉素能抑制细菌细胞壁的合成；链霉素能抑制细菌蛋白质的合成配制：100万ug硫酸链霉素以10mlHanks液或三蒸水溶解；用8ml硫酸链霉素液溶解80万u青霉素粉；即成青霉素、链霉素各10万u、10万ug/ml的母液使用：每100ml培养基中加0.1ml母液。即培养基内青霉素、链霉素的最终使用浓度为100u、100ug/ml（2）卡那霉素液作用：抑制细菌蛋白质合成配制：1瓶卡那霉素（50000ug）溶于5mlHanks液，即成10000ug/ml的母液使用：每100ml培养基中加0.5ml母液。即使用终浓度为50ug/ml（3）制霉菌素液作用：干扰霉菌细胞质膜的合成用法：首先制成5000u/ml的悬液，使用时每100ml培养基中加0.5ml悬液。即使用终浓度为25u/ml抗生素减少污染的机会，有许多缺点：促进抗药性有机体的生长；掩盖低水平、隐蔽性的污染；掩盖了支原体感染；产生了抗代谢效应，并能与哺乳动物细胞产生交叉反应；使无菌操作水平下降。