细胞工程第五周

普通细胞培养室内走廊普通细胞培养室一角万级层流细胞培养室PowerPointwatersugarThePowertoAnimate第三章细胞培养用液及培养基•第一节细胞培养的营养条件及影响因素•第二节细胞的冻存与复苏•第三节细胞培养污染的检测和扫除••第四节细胞原代培养与建系第一节细胞培养的营养条件及影响因素•离体培养细胞与体内细胞在营养要求上的主要差别如下：•（1）体外长期培养的细胞大多需要血浆、血清或胚胎浸出液，而这类培养液都可能含有微量的激素、维生素及必要的氨基酸，足以供给细胞营养的需要。（2）在体内血液中许多活性很强的物质只需微量即可维持营养的需要，而在体外培养时无法观测，量多了可能与微量的作用不同，量少了又可能很快就会消耗掉。•(3)组织培养是一群离体细胞，而这些细胞有不同的营养要求。这种不同的营养要求在体内因有别种器官和组织细胞的活动而间接供给，但在培养基中则没有这种供给，也不受其他组织代谢的影响。•（4）各种组织都有其特殊的营养要求，能适合某一种组织的培养液，不一定就能适合另一种组织的细胞，其差异有时较大。•（5）在体内的细胞，其新生与衰亡维持一种平衡，而在体外培养时，细胞增生，体积加大，增殖速度往往高于分化速度，新生细胞比衰亡细胞要快，所以营养要求自然也不同。凡能进入细胞中被细胞所利用，参与细胞代谢活动和维持细胞生存的物质均属营养物质。体外培养细胞的生长所需的基本营养物质，除碳水化合物、氨基酸和脂类三大类营养物质外，也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素等。WATERwater1、水细胞培养用水凡能进入细胞中被细胞所利用，参与细胞代谢活动和维持细胞生存的物质均属营养物质。体外培养细胞的生长所需的基本营养物质，除碳水化合物、氨基酸和脂类三大类营养物质外，也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素等Animating水是一种良好的溶媒。人体细胞中大部分是水。一切营养物质只有溶于水，才易被细胞吸收。代谢产物也需溶于水才能排泄。生化反应也必须在溶液状态下才能很好起作用。水的比热高、潜热大，对调节温度起着很大作用。water水有一定的表面张力，对生物形态的保存也有一定作用，且原生质的活动需要水的表面张力。没有水，水解反应和氧化作用无法进行。水也影响呼吸。水还便于溶质物质的转移。水水水作为一种导热体，对生物体内环境温度的调节起重要作用。水中有溶解氧的存在，可供细胞呼吸，可维持水中有机体的生存。细胞培养用水必须经过2～3次玻璃器皿蒸馏或者用离子交换树脂处理的水。这样的水含杂质少、纯度高，应用起来安全可靠。一般在电导仪上表示200～300万Ω以上方可使用，生长液要在500万Ω以上。SUGARSugar2、糖AnimatingAnimating细胞靠糖的氧化来获得能量。葡萄糖是机体活动能量的主要来源。故在培养液中应加入一定浓度的葡萄糖(1g%)，以在生物氧化后供给细胞大量的能量。近年证明谷氨酰胺也是碳的重要来源。葡萄糖葡萄糖葡萄糖的作用与平均细胞容积有直接的关系，而与细胞数的变化关系较小。很多健康胚细胞和成体细胞，皆依赖无氧酵解来获得能量，有些细胞也可以经脱氨获得基本能量。氨基酸是组成蛋白质的基本单位。所有培养细胞需要以下12种基本氨基酸：精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、胱氨酸及酪氨酸。另外尚需谷氨酰胺。氨基酸是组成蛋白质的基本单位。所有培养细胞需要以下12种基本氨基酸：精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、胱氨酸及酪氨酸。另外尚需谷氨酰胺。谷氨酰胺对细胞具有特殊作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜。它所含的氨又是核酸中嘌呤和嘧啶的重要来源，同样也是合成3，2和一磷酸腺苷时的所需物，也是能源和碳的来源。因此，谷氨酰胺对培养细胞非常重要，肿瘤细胞培养时比正常细胞需求量高1倍。很多细胞在含氨基酸的培养液中生长良好，尤其是在单细胞培养或培养细胞较少时，需要氨基酸的种类和量要比上述的多。有时细胞培养还加以下7种氨基酸，即天门冬氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸（非必须氨基酸）。尤其是丝氨酸对很多癌细胞、成纤维细胞生长很重要。细胞只能利用左旋的异构体，而右旋的即使超量也无用。半胱氨酸的主要作用是保护酶的活力，可消除培养液中的微量金属与细胞内酶结合后形成的抑制硫苷酸；可增加细胞的增生数和改善细胞的外形，延长细胞的生存时间。目前采用的浓度增加到26g/L，需新鲜配制于母液中，否则因氧化作用而失去效应。Glycine,-Gly甘氨酸甘氨酸是一种最简单的氨基酸。它对细胞的大量生长有一定的促进作用。可通过转氨基作用形成丙氨酸、谷基酸与苯丙氨酸，反过来丙、谷氨酸，谷氨酰胺也可通过转氨基作用形成甘氨酸。使用浓度一般为50mg/L。Serine,Ser丝氨酸丝氨酸并不是必需的氨基酸，可部分地被甘基酸、丙氨酸或几种不重要的氨基酸结合物所代替，但它对肿瘤和成纤维细胞有促进生长的作用，如果与丙氨酸、α-氨基酪酸、天门冬酰胺结合，能进一步增加丝氨酸的促进作用。适宜用量为0.5～1.0mmol/L。Tryptophane,Trp色氨酸色氨酸的主要作用是可通过转氨基作用产生丙、甘、酪氨酸。适宜用量为0.005～0.02mmol/L。ArgnineArg精氨酸精氨酸对细胞的增殖是重要的。如果缺少它，细胞生长受到抑制。但如果有血清蛋白存在，精氨酸酶的活力受到抑制，精氨酸分解受阻，细胞生长受影响。支原体污染细胞后使精氨酸大量消耗，细胞增殖受抑制，甚至死亡。Asparticacid,Asp天冬门氨酸天冬门氨酸主要来自植物性蛋白水解后产生。另外谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸可经转氨基作用而形成天冬门氨酸。高度分化的细胞可通过生物合成的途径取得天冬门氨酸。维生素是人类及动物细胞维持生命和生长所需的一种活性物质。许多维生素是酶的辅酶和辅基的组成部分，对细胞的代谢有重大的影响，某些维生素缺乏，短期可引起细胞死亡。Vitamin,维生素是意译，即维持生命的元素。4、维生素溶性维生素对细胞生长也有作用，它们常从血清中得到补充。维生素C也是不可少的，它对具有合成胶原能力的细胞尤为重要，但维生素C易氧化，不很稳定。维生素的需求量随细胞而异,如生物素、叶酸、胭酰胺、泛酸、吡多醇、核黄素、硫胺素及B12等在很多常用限定培养基中已成为固定组成成分。钠、钾、镁、钙、磷、氮等无机离子是细胞生长所必需的，它们参与细胞的代谢，是细胞组成所需要的。此外,微量元素铁、锌、硒等也是细胞生长所需要的.细胞培养时用的平衡盐溶液主要含钠、钾、钙、镁等阳离子，其比例与海水或高等动物血液内的比例相似。5、无机离子和微量元素钠在体内主要维持水、渗透压及pH的平衡。钠离子是细胞外主要的阳离子，它可降低外质的粘度，促进外质的溶胶化，而在细胞内则可增加内质的粘度，能使球蛋白保持溶液状态，能增加组织细胞的应激性与增高细胞膜的渗透性，对维持渗透压的恒定及细胞内外物质的转运有决定性作用。在L和HeLa细胞培养时，Na+最适浓度为100～200mmol/L，CI-的适宜浓度为50mmol/L（淋巴细胞除外）。(1)钠钾是激活细胞内某些酸所必需的。L与HeLa细胞对钾的最适浓度是1～10mmol/L。HeLa细胞缺钾18小时以上，细胞变圆，胞质内颗粒增加，细胞界限不清楚，并产生一种特殊的树枝形细胞，24小时后细胞脱落死亡。(2)钾钙对维持细胞膜的坚固和渗透性，对保持神经和肌肉组织的正常兴奋性有很大作用。许多酶如胆碱酯酸、琥珀酸脱氢酶、三磷酸腺苷酸等都必须有钙的存在才有活性。钙对细胞粘着性也很重要，在无血清存在时，高浓度的钙离子可帮助细胞贴壁，如pH7.6～PH7.8时钙离子保护带电荷群，使细胞稳固的贴壁。各种细胞所需钙的浓度不同，L细胞的最适浓度是1～2mmol/L，HeLa细胞的最适浓度是0.1～0.2PH。（3）钙在细胞内镁是糖代谢某些酶系统的参加者。镁对细胞的贴壁也有重要作用，较高的镁离子可促进培养物的生长。鼠成纤维细胞最适浓度是0.1～0.2mmol/L。Mg(4）镁磷酸盐是细胞和细胞间液的组成成分，它参与一切基本物质如蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素的代谢，是能量ATP必不可缺的成分，可形成高能磷酸键以供细胞生命活动所需之能量。另外,它对维持组织内的酸碱平衡起着重要作用。L细胞的适宜浓度是0.2～0.6mmol/L，HeLa细胞适宜浓度是0.06～0.2mmol/L。(5)磷重碳酸盐与CO2对细胞的生长和增殖很重要。它能使培养物产生最大糖分解以利细胞生长，可维持和调节培养基的pH，因此通常在人工培养箱中培养。C(6)碳铁、锌、硒等微量元素对维持细胞的正常生理功能也同样起着重要作用。如铁是组成细胞色素与细胞色素氧化酶等物质的成分；锌与细胞增殖有一定的关系。在体内它们大多数与有机化学物相结合。在组织细胞培养时，把上述微量元素加到人工培养基中，低浓度或适量对细胞的生存与增殖有一定作用，浓度过高对细胞有毒性，要特别注意。各种细胞对无机盐的需要是不同的。一般来说，氯、钠、钾、钙、镁、磷是重要的无机盐成分，它们也有相互拮抗作用。如钙和镁能使细胞膜渗透性降低，而钾和钠能使细胞渗透性增高。钾和钠能使肌肉收缩性丧失，而钙和镁能恢复肌肉的收缩性。镁的毒性作用可用钙来解除。因此,这些离子在溶液中只有保持一定的比例，才可以使细胞维持正常的生理平衡状态。(7)微量元素体外培养细胞除需要上述营养成分外，同样需要促进细胞生长的激素类物质，尤其是促细胞生长因子。如胰岛素能促使细胞利用葡萄糖和氨基酸，有促进有丝分裂作用，对很多细胞的增殖生长均有促进作用。氢化可的松对皮肤上皮细胞及乳腺上皮细胞增殖生长有很好的促进作用，还能提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率。血清中含有多种促细胞生长的因子，是体外培养细胞所需生长因子的重要来源。血清中含有A、B、C、D四种因子。A因子能促进细胞早期生长，缩短潜伏期，清除细胞内脂肪滴。A因子比较小，呈酸性，可很快地通过火棉胶膜。6、促生长因子若使B、C因子除去，则可促进细胞生长。血清中的球蛋白及肽对细胞有刺激性生长的作用，白蛋白不仅具有解除某些毒性物质（如油酸和重金属离子）对细胞的毒性作用，而且能支持细胞的生长和增殖。B因子是一种脂肪形成剂，易使细胞产生脂肪滴，其本身是可溶性脂类，但不能通过火棉胶膜。B因子在老年血清中含量较多，过滤可除去该因子。C因子可使细胞发生退化。D因子可促使细胞粘连，是一种粘着因子。(1)年龄较老动物的血清对细胞生长有抑制作用。其抑制成分存在于血清的类脂质与蛋白质部分，并能耐热至65℃.随着年龄的增加，血清卵磷脂含量下降，而类脂质、蛋白质与抑制剂的浓度增加（B因子也随之增加），对细胞生长不利。血清对体外培养细胞固然重要,但有不少因素可影响血清的作用,如供血者的年龄、血型、血色素、胆红质、脂肪酸等。(3)血色素BaRa发现低浓度的血色素可引起正常与恶性的鼠成纤维细胞的增殖，而高浓度血色素可产生抑制作用。因此在制备血清时，必须尽量避免溶血。(2)血型一般认为AB型血清比A型和O型血清对细胞生长有利，原因不清。(5)脂肪酸血清中的脂肪酸的含量对细胞生长有很大的影响。老年动物血清中脂肪酸的含量较高；雌性动物血清中脂肪酸的含量较雄性高。因此制备血清时应选择雄性幼年动物。(4)胆红质低浓度一般对细胞生长影响不大，对有的细胞有抑制作用。因此在选血清时，也应注意这个问题。由于生物工程技术方法的开发和进步，现已从血清、各种组织和其他生物成分中制取出多种促细胞生长物，并已商品化(见表2-1)。血清在培养液中的浓度并非越高越好。原则上是能达到维持细胞良好的生长和繁殖，又不浪费。一般常用的比例是