实验二 细菌革兰氏染色

实验二细菌革兰氏染色一、实验目的学习微生物制片、染色的基本技术掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术进一步观察细菌的基本形态C.Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。二、实验原理革兰氏染色1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色。4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色占细胞壁干重的%成分革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高（50~90）含量很低（~10）磷壁酸含量较高（＜50）无类脂质一般无（＜2）含量较高（~20）蛋白质无含量较高三、实验材料1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S）2、染料：结晶紫、复红、碘液等3、材料：95%酒精等4、标本片：芽孢、荚膜、孢子丝涂片—风干—固定—初染—水洗—媒染—水洗—脱色—水洗—复染—水洗—干燥—镜检四、实验方法（一）革兰氏染色菌悬液涂片干燥滴加无菌水固定取菌苔涂片SmearpreparationHeatfixingcrystalvioletstainwashwithwaterStainingCounterstainwithSafranin注意事项：（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。（4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。（二）观察细菌的特殊结构1、荚膜2、芽孢3、孢子丝五、思考题1、讲述革兰氏染色的原理，并指出E.C和B.S分别属于革兰氏阳性或阴性？2、绘图表示三种细菌的特殊结构。3、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色成败的关键一步是什么？4、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色技术和结果的正确性？