实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定

生物化学与分子生物学实验实验二蛋白质的两性反应与等电点测定生物化学与分子生物学实验了解蛋白质的两性解离性质掌握测定蛋白质等电点的方法实验目的生物化学与分子生物学实验PCOOHNH2PCOO-NH3+PCOO-NH2PCOOHNH3+pH=pI+OH-pHpI+H++OH-+H+pHpI兼性离子阳离子阴离子实验原理生物化学与分子生物学实验在等电点时蛋白质颗粒上的净电荷为零，缺乏同电相斥的因素，蛋白质溶解度最小，最容易析出沉淀维持蛋白质胶体稳定的因素：表面电荷、水化膜生物化学与分子生物学实验本实验配制了各种不同pH值的缓冲液，沉淀出现最多的缓冲液pH值即为酪蛋白的等电点生物化学与分子生物学实验实验器材与试剂大试管、滴管、刻度吸量管0.5％酪蛋白醋酸钠溶液0.01％溴甲酚绿指示剂(指示范围:pH3.8-5.4)0.02MHCL溶液、0.02MNaOH溶液0.01M醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、1.00M醋酸溶液生物化学与分子生物学实验蛋白质的两性反应（1）实验步骤取一干净试管酪蛋白液10滴溴甲酚绿指示剂3滴观察溶液颜色并解释现象生物化学与分子生物学实验蛋白质的两性反应（2）滴加0.02MHCL溶液边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加0.02MHCL溶液边滴加边混匀生物化学与分子生物学实验蛋白质的两性反应（3）继续滴加0.02MNaOH溶液边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加0.02MNaOH溶液边滴加边混匀生物化学与分子生物学实验溶液呈蓝色蛋白质的两性反应(1)实验结果酪蛋白溶液呈碱性(pH﹥5.4)，使溴甲酚绿指示剂显蓝色生物化学与分子生物学实验[H+]，沉淀蛋白质的两性反应(2)出现最大量沉淀时,说明到达了酪蛋白的等电点溶液由蓝色变成浅绿色（3.8﹤pH﹤5.4）生物化学与分子生物学实验继续加酸，[H+]继续增大，pH＜pI。酪蛋白所带正电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解沉淀完全溶解时，溶液显黄色(pH﹤3.8)生物化学与分子生物学实验[OH-]，沉淀蛋白质的两性反应(3)出现最大量沉淀时,说明到达了酪蛋白的等电点溶液由黄色变成浅绿色（3.8﹤pH﹤5.4）生物化学与分子生物学实验继续加碱，[OH-]继续增大，pH﹥pI。酪蛋白所带负电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解沉淀完全溶解时，溶液显蓝色(pH﹥5.4)生物化学与分子生物学实验结论1：酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4之间pH=pI时，蛋白质溶解度最小蛋白质是两性电解质生物化学与分子生物学实验取7支同样规格的干燥试管，精确加入各试剂试管号码1234567蒸馏水2.43.2—3.01.52.753.381.00M醋酸1.60.8—————0.1M醋酸——4.01.0———0.01M醋酸————2.51.250.62pH3.53.84.14.75.35.65.9酪蛋白等电点的测定注：单位均为mL生物化学与分子生物学实验向每个试管中各加0.5%酪蛋白溶液20滴，加一管，立即混匀一管静置30分钟后，以0、+、++、+++、++++表示各管的混浊度，并指出哪一种pH是酪蛋白的等电点生物化学与分子生物学实验1234567沉淀量0++++++++++00酪蛋白等电点的测定1234567实验结果生物化学与分子生物学实验结论2：4号试管沉淀量最多说明4号管溶液的pH值为酪蛋白的等电点，即pI=4.7生物化学与分子生物学实验什么是蛋白质的等电点？在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？思考题生物化学与分子生物学实验实验项目实验原理试剂和器材操作方法（主要步骤）结果分析思考题生物化学与分子生物学实验实验三凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾预习