核酸研究的基本技术

江红三所五室核酸研究的基本技术1.核酸的分离、纯化和鉴定:基因组DNA、质粒、总RNA2.PCR技术:反应体系、常见的PCR技术、PCR产物的克隆、表达、鉴定3.核酸分子的杂交:Southern-blotNorthern-blot4.新基因的克隆和功能研究Tm值(DNA的熔点或解链温度)概念：指加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度。一、核酸的分离、纯化和鉴定1.基因组DNA的分离、纯化：PCR、Southern-blot、构建基因组文库实验材料：哺乳动物组织(50~100mg)哺乳动物细胞(5x106~107)实验步骤：RT匀浆：TEpH8.0组织(液氮冻存、研磨)消化：EDTA、SDS、蛋白酶K、RNase37℃/55℃抽提：酚、氯仿、异戊醇沉淀：异丙醇/NaAc+无水乙醇洗涤：75％乙醇干燥：风干溶解：TE/H2O注意事项：1.试剂：pH值准确2.蛋白酶K：20mg/ml，分装，-20℃，避免反复冻融3.抽提：完全，不要触及蛋白层4.干燥：避免过分5.操作：小心，机械剪切作用，80~100kb2.总RNA的分离纯化:RT-PCR、Northern-blot实验材料：哺乳动物组织(50~100mg)哺乳动物细胞(5x106~107)实验步骤：匀浆：Trizol组织(液氮冻存、研磨)抽提：氯仿沉淀：异丙醇/NaAc+无水乙醇RT15min洗涤：75％乙醇干燥：风干溶解：DEPC-H2O保存：分装，-70℃，避免反复冻融注意事项：(1)无RNase环境：手套勤换、试剂专用、DEPC处理玻璃器皿：180ºC干烤8小时以上塑料器皿：氯仿冲洗0.1%DEPC水溶液浸泡(RT12h或37ºC2h)，高压灭菌去除DEPC(2)样品保存：材料+Trizol：-70℃1m材料:液氮长期RNA沉淀+75％乙醇：RT1w-20℃1y3.核酸的鉴定生物学活性物理化学指标相对分子量紫外吸收沉降系数电泳迁移率粘度(1)核酸的定量：OD260：DNA,RNA;OD280：蛋白质浓度：1OD260：50μg/mldsDNA40μg/mlssDNA，总RNA35μg/ml单链RNA20μg/ml单链寡核苷酸核酸纯度:OD260/OD280DNA1.8RNA1.7~2.12.0OD260和OD280应大于0.05，(2)核酸的凝胶电泳：分离、纯化琼脂糖凝胶电泳：agarose,水平,TAE,EB(2ng),紫外灯总RNA1%agarose迁移率：同样大小的分子超螺旋》线性分子》缺口或松弛DNAMarker:DL2000,λDNA/HindⅢ聚丙烯酰胺凝胶电泳:PAGE(Acr+Bis)，垂直，银盐染色非变性，变性4.质粒：概念：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA分子。载体：指可容忍外源DNA片段插入、可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。如:细菌质粒、噬菌体和某些病毒组成：复制子、启动子、多克隆位点、选择标记基因复制子：ColE1,pMB1,pSC101，控制着质粒在细菌中的拷贝数。启动子：位于表达载体，启动基因的转录，如Ptac,PCMV,PSV40等。多克隆位点(MCS)：人工合成的含多个单一限制性内切酶识别位点的一段特殊的DNA序列，便于酶切、插入重组和克隆DNA分子。选择标记基因：Ampr、Tetr、Kanr、Neor分类按用途分类克隆载体表达载体：含有强启动子，使克隆化的外源基因转录产生大量的mRNA。依其发挥作用的宿主细胞不同，分为原核、真核、酵母、昆虫、病毒表达载体。按复制能力分类严谨性质粒：它们的复制伴随着染色体复制，1～几个拷贝。松弛型质粒：它们的复制与染色体复制无关，10~200拷贝，常用。大小：1kb~200kb质粒的不相容性：两种亲缘关系密切的不同质粒不能稳定共存于同一个大肠杆菌菌株内,随细胞分裂分别进入不同子代细胞的现象。DNA分子同源性相同阻碍蛋白相互抑制穿梭质粒：人工构建两种不同复制起点和选择标记两种不同的宿主细胞中存活和复制转移基因基因表达活性和功能分离：碱裂解法、煮沸法：剧烈，小质粒去污剂(SDS)裂解法：易受损的大质粒(15kb)碱裂解法收菌重悬：TE-葡萄糖裂解：变性，NaOH-SDS5min中和：复性，KAc抽提：酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)沉淀：异丙醇洗涤：70％乙醇溶解：TE-RNaseA纯化：氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心聚乙二醇分级沉淀法Kit:碱裂解，DNA介质(硅胶、玻璃奶)α互补现象pUC系列质粒(lac操纵子)β-半乳糖苷酶氨基端细菌(β-半乳糖苷酶N-末端缺陷型)蓝色菌落外源DNA插入白色菌落β-半乳糖苷酶诱导物IPTG生色底物X-gal缺陷型蓝白筛选1.原理2.反应体系3.类型4.PCR产物的克隆、表达和鉴定二、PCR(聚合酶链式反应)技术1985,MullisK,PCR，Klenow1988,Saiki,Taq酶1、原理:模板变性、引物退火、DNApol进行DNA合成第二轮扩增第一轮扩增引物与模板结合模板第三轮扩增PCR产物呈指数方式增加25~30个循环理论109实际105~1072、PCR反应体系：25～100μl1)模板DNA：单链或双链DNA,避免DNA聚合酶抑制剂和能结合DNA的蛋白质污染,1～0.1μg。2)引物：人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。20pmol3)Mg2+的浓度：反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。4)dNTP：50~200µmol/L，四种dNTP浓度相同。5)TaqDNA聚合酶：Klenow,Taq酶,高保真Taq酶,2.5U/100μl。6)参数：94℃5min-30×(94℃30sec-55℃30sec-72℃1min)-72℃7min1)长度一般为18~25个碱基；2)尽可能选择碱基随机分布的序列；3)两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为45~55%；4)避免引物内部形成二级结构；5)两引物之间不应发生互补，特别是在3´端;6)引物3´末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率，最好选T、G或C，而非A；7)引物5´端允许有一段序列不与模板配对,内切酶，保护碱基。引物设计原则退火温度计算公式：1)T=2×(A+T)+4×(G+C)-3~52)T=22+1.46ln±3~5ln=2(GorC)+(AorT)20~35nt3)T=81.5+16.6lg[J+]+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%)[J+]=monovalentcationsl=oligonucleotidelengthFA=formamide14~70nt低温度55℃高温度Taq酶合成延伸速率：22℃0.25nt/sec，37℃1.5nt/sec，55℃24nt/sec，70℃60nt/sec1.Taq酶单克隆抗体:低温与Taq酶结合，抑制活性;高温与Taq酶解离，释放活性。2.模板变性后加入Taq酶。热启动PCR:提高特异性3、影响因素模板：ng级的质粒DNA，μg级基因组DNA。引物：引物浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体。Mg2+浓度：特异性及产量dNTPs浓度：正确性和产量Taq酶用量：非特异性循环参数：常规为25~30个循环对照：阳性对照阴性对照：不加模板4、特点：特异性、有效性、忠实性•操作简便省时；•灵敏度高；•特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可以提高特异性；•对原始材料的质量要求较低；•有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为TaqDNA聚和酶缺乏3’→5’核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入。1)反转录PCR：RT-PCR5、常见类型AAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOligo(dT)n反转录酶RNaseHPCRAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA关键：总RNA完整性反转录引物随机引物特异下游引物第一轮PCR第二轮PCR2)巢式PCR:模板数低123432143)RACE:cDNA末端的快速克隆AAAAAm7Gppp5’3’5’RACE3’RACE3’RACEGSP1Q0GSP2Q1第一链cDNATTTT-Q1-Q0TTTT-Q1-Q0mRNAAAAAAAGSP1GSP2Q0Q1反转录第二次扩增第一次扩增5’RACE方法一：Cap-Finder方法二GeneRacer连接头去5’-PO4(牛小肠磷酸酶)去5’cap(烟草酸焦磷酸酶)cDNA第一链5’末端3’末端1.第一链的合成至关重要1)确定所需的mRNA的存在2)mRNA中存在的稳定二级结构可能对反转录有影响，采用热稳定的具反转录活性的DNA聚合酶2.反转录结束后通过两次NH4Ac沉淀去除多余dNTP和引物3.内源性同聚序列的影响1)降低引物的用量0.5pmol/µgmRNA/20µl反应体积2)避免太低的杂交温度注意4)长片段PCRTaq酶：LATaq酶5U/50μl反应dNTP:2.5mM8μl延伸：5min循环：256)差异PCR5)DNA指纹分析：随机引物单位点微卫星多态性分析随机扩增多态DNA分析：RAPD扩增片段长度多态性分析：AFLPDNA单链构象多态性分析：SSCP遗传学图谱绘制、系统生物学、发育生物学1)大量扩增目的核酸片段2)克隆新基因3)生物多态性的研究4)核酸测序5)在核酸中引入突变6)检测基因的整合、表达情况7)疾病的诊断6、PCR在生物学中的应用1.需突变位点位于基因两侧，只需在合成引物时，直接加上突变碱基即可；2、当突变位于基因的中间部位时，可以采用以下两种方法进行突变在基因中引入突变2113第一轮PCR第二轮PCR方法一123414方法二第一轮分步PCRPCR产物互补Taq酶第二轮PCRDNA的序列测定：Sanger双脱氧链终止法测序的原理单链模板DNA测序引物5´3´4种dNTP(包括[32P]dNTP)DNA聚合酶ddTTPddCTPddGTPddATP造成链末端终止的双脱氧核苷酸新合成的DNA1)阴阳性对照2)配制PCR混合物PCRbuffer+dNTP+H2O3)控制污染:靶序列污染，气溶胶紫外线照射更换实验场所、设备、试剂暂停实验7、注意事项8、限制性核酸内切酶核酸酶：是一类能切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，使核酸分子多核苷酸链发生水解的蛋白酶。基因工程中最常用的核酸酶是核酸内切酶。限制性核酸内切酶:简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，它能特异地结合于限制酶识别序列或其附近的位点，并在此切割双链DNA分子。概念分类I类:识别部位复杂，特异性差，在识别序列周围400~7000bp范围内切割DNA。II类：能识别双链DNA的特定序列并进行切割，产生特异的DNA片段，常规应用于分子克隆中。III类：在识别位点周围27~27bp范围内切割DNA。命名原则EcoRI第一个大写字母：属的缩写两个小写字母：种的缩写第二个大写字母：不同变种和品系的缩写罗马数字：同一微生物中多种限制酶分离的顺序特征识别序列：4~6个核苷酸，迴文结构。切割产物：同时切割dsDNA的两条链平滑末端或粘性末端CCCGGGGGGCCCSmaⅠCCCGGGGGGCCC+GAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG+EcoRⅠ酶活性单位一个活性单位：在适当的反应条件，1小时，完全酶解1μgDNA底物，限制性内切酶的量。单酶切/双酶切反应：30μl37℃4hDNA3μg10×buffer3μl限制酶1μl(×2)H2O补足体积标准的酶解反应：50μl反应体系，1U内切酶，最适反应条件，1小时，1μgDNA完全降解。影响活性因素DNA：纯度、甲基化程度、分子结构缓冲液：pH值溶液：离子种类及浓度消化反应的温度反应体系中甘油浓度指改变酶反应条件时，酶原有的识别特异性降低的现象，即限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别序列相似的序列。一般在相应限制酶的名称右上角加一个星号(*