核酸适配体

SAPTAMER适配体Aptamers(fromtheLatinaptus-fit,andGreekmeros-part)S核酸适配体（NucleicAcidaptamers）S多肽适配体（Peptideaptamers）什么是核酸适配体？S核酸适配体是具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合的，人工合成的核酸。它可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25~60个核苷酸。它是一系列单链核酸分子，与长度相同的特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体可以结合的靶分子有小分子、蛋白、细菌、病毒、细胞和组织等。核酸适配体概念的提出S1989年，悉尼·奥尔特曼、托马斯·切赫因为对RNA的催化作用的研究共同获得诺贝尔化学奖。支持RNA为生命起源假说的可能证据：S如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生物；S如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性RNA的痕迹；S如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列。生命活动的基础是什么？--Binding!S如果我们都能找出一个有相当强亲和性和特异性的RNA序列，那我们就向证明RNA起源说迈出了一步。S1990年，两个研究组几乎同时用T4DNApolymerase与几种有机染料做靶分别筛选出了特异性结合的RNA分子，并把这种RNA叫做aptamer。S1992年Ellington和Szostak又用相似的方法筛选出了可以和靶分子特异性结合的单链DNA分子，从而证明了单链DNA也可以折叠成特殊的三维结构，并暗示DNA可能也会具有催化活性。1TuerkC,GoldL.1990.Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment:RNAligandstobacteriophageT4DNApolymerase.Science249:505–10；2EllingtonAD,SzostakJW.1990.InvitroselectionofRNAmoleculesthatbindspecificligands.Nature346:818–22自然界中Aptamer存在的证据：RiboswitchesSRiboswitches:theoldestmechanismfortheregulationofgeneexpressionS核糖开关是2002年，由耶鲁大学的分子生物学家RonaldBreaher和他的同事在受Andrew等人的研究成果启发下发现并命名的，它是能够与代谢物或其他小分子配体结合，通过构象变化调控目的基因转录或翻译的RNA结构元件。Aptamer巨大的应用前景SAPTAMERS:ANEMERGINGCLASSOFTHERAPEUTICS（.Annu.Rev.Med.2005.56:555–83）SAnalyticalApplicationsofAptamers(AndrewD.Ellington.AnnualReviewofAnalyticalChemistry(2008).Volume1,Jul2008)核酸适配体的第一个临床应用S2005年12月20日，美国FDA宣布批准哌加他尼钠注射液（Macugen）用于治疗眼科疾病新生血管型（湿性）老年黄斑病变（Age-RelatedMacularDegeneration，AMD）患者的视力缓慢丧失。SMacugen是一种选择性血管内皮生产因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）拮抗剂。核酸适配体的化学本质与识别机理S核酸适配体的化学本质是核酸，它与配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stemloop)、G2四分体(G2quartet)等稳定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和力和高特异性。S经过SELEX技术反复筛选的适配体能与靶分子以极高的亲和力和特异性相结。核酸适体与靶物质亲和力极高，kd值多在pmol/L-nmol/L之间。StructureofanRNAaptamerspecificforbiotin.Theaptamersurfaceandbackboneareshowninyellow.Biotin(spheres)fitssnuglyintoacavityoftheRNAsurface核酸适配体的筛选策略S核酸适配体的体外筛选是利用SELEX技术（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)）来完成的，SELEX是指数富集配体系统进化的简称，它的基本原理就是就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20～100个碱基左右．将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基(aptamer)，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。SELEX筛选流程S首先，确立筛选方法。根据不同的配体选择具有不同特性的适配体并以此确定具体的适配体筛选方法；S其次，建立筛选文库。人工建立一个约含有1015个不同寡核苷酸的随机序列库，随机序列的两端为固定序列，是之后PCR循环中要用的，如果是筛选RNA-aptamer，要在5´端引物中加上一段T7启动子，以便识别转录过程中所需要的T7RNA聚合酶，把靶分子加入到该库中，充分结合后，将与靶分子结合的寡核苷酸序列分离出来。S然后，通过PCR或RT-PCR等技术进行扩增，生成次一级文库，次一级文库再与配体结合，反复多次循环，随着每一轮筛选条件的不断提高，与靶目标高度特意结合的DNA或RNA分子呈指数增长，而亲和力低的序列逐步被淘汰，直到获得合适的序列。筛选流程图核酸适配体筛选中的分离方法S毛细管电泳S超滤离心膜分离法S硝酸纤维素膜分离法S亲和介质分离用SELEX技术筛选核酸适配体的过程中，关键步骤之一是对结合靶分子的序列与未结合靶分子序列进行高效分离。主要分离方法有：毛细管电泳S毛细管电泳的原理是基于不同组间荷质比差异导致的电泳迁移率不同而进行分离，在电场中，待分离组分在50~75μm内径的毛细管中因荷质比差异导致不同的迁移速度而得到分离，当靶分子与其aptamer亲和作用足够强,形成的复合物足够稳定时，在合适的分离和检测条件下，可分别得到游离的寡核苷酸与复合物的电泳峰。超滤离心膜分离S超滤离心膜有两部分组成，一部分为滤膜滤芯．另一部分为套管，进行分离离心时套管套住滤芯，将需要分离的液体加在滤芯上．通过高速离心将不与靶标结合的游离寡核苷酸滤掉，将与靶标特异性结合的ssDNA留在超滤离心膜上。超滤滤离心膜在SELEX技术中的应用可以满足分离要求，而且操作简便。亲和介质分离S一些具有亲和表面的介质也用于适配体的筛选，如琼脂糖、纤维素及具有亲和表面的小珠或小柱等。S如J.ColinCox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成了溶菌酶适配体的自动化筛选。具体流程为：通过链酶亲和素与生物素的相互作用，将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。随后特异结合序列的分离，RT-PCR扩增和转录都通过设定的程序自动完成，最后筛选得到的序列克隆到载体中进行测序鉴定。通过这种自动化筛选工作台，Cox等只用了不到两天的时间就完成了12轮的筛选。核酸适配体的应用S核酸适配体在分析化学中的应用S核酸适配体与疾病诊断和新药研发核酸适配体在分析化学中的应用S靶物质的分析与检测该方面应用的基本思路是将各种报告基团，如荧光试剂，定点标记在aptamer核苷酸上，然后在一定条件下，使aptamer与靶物质发生相互作用，再通过对报告基团的信号检测实现对靶物质的定性检测或定量分析。Tan等将aptamer应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方法—分子aptamer信标(MAB)。他们将凝血酶aptamer的5´和3´端分别标记上荧光素和猝灭剂，凝血酶不存在时，aptamer分子呈茎环结构，两端的荧光素与猝灭剂相互靠近发生能量转移而观察不到荧光；在结合凝血酶后aptamer分子构象改变，致使MAB的荧光素与猝灭剂分开从而可以检测到荧光信号，并且随着凝血酶浓度的增加荧光强度增强。S蛋白质检测Lindner等发展了一种基于aptamer芯片的蛋白质检测方法，将能特异识别IgE的ssDNA-aptamer和IgE抗体分别固定在芯片上，然后将IgE与其温育，发现aptamer对IgE的特异性和敏感性比IgE抗体更好。该方法对IgE的检测限达到10ng/ml。Lindner等还通过aptamer芯片系统成功地从混合蛋白质中识别出专一性的蛋白，而且利用凝血酶aptamer证明了在同一芯片上同时检测两种蛋白方法的可行性。总之，寡核苷酸aptamer作为低分子量的分子受体，它在芯片上能专一性地检测蛋白质而且很稳定，以它为阵列来捕获蛋白质将为蛋白质组学研究的发展起到重要作用。S基于适配体的生物传感器是用适配体作为识别元件来特异性地检测其相应的靶物质。S目前适配体生物传感器（Aptasensors）尚处于起步阶段。ChunyanYao等将IgE适配体固定在石英晶体微平衡生物传感器阵列，建立了适配体压电石英生物传感器模型，用于特异性检测标准溶液和人血清中的IgE。该方法最低可在标准和人血清溶液中分别检测出2.5-200ug/L的IgE，整个检测时间只需15min，而且固定在金膜表面的适配子在反复洗脱后并不影响其灵敏度。S针对三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子优先结合,而带有正电荷的PDDA会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集,从而颜色由红变蓝实现比色法测定水产品等间接摄入方式。Kim等人筛选出一种核酸适配体通过构型转换形成特定的二级结构用于绑定地下水中三价砷和五价砷，结合常数分别可达7nmol/L和5nmol/L[12]。Zhou等人通过核酸适配体和金纳米粒子利用比色法实现对三价砷离子的快速检测，针对三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子优先结合，而带有正电荷的PDDA会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集，从而颜色由红变蓝实现比色法测定(见图2)，检出限可达5.3ppb[13]。图2核酸适配体用于As3+的检测示意图Fig.2.SchematicrepresentationofdetectionofAs3+usingaptamer汞离子是一种高毒性并分布广泛的污染物，在鱼类及贝类中常常以甲基汞的形式存在。汞通过食物摄入后对人体的危害主要累及中枢神经系统、消化系统及肾脏，此外对呼吸系统、皮肤、血液及眼睛也有一定的影响。Chang等人利用核酸适配体与铅和汞分别形成G-quartet结构和发卡结构的构型实现了对铅和汞的同时测定(见图3)[14]。Choo等人开发了一种表面增强拉曼光谱微滴传感器，利用核酸适配体修饰的纳米粒子实现了对汞离子的高灵敏快速检测，检测限可达10pmol/L[15]。图3核酸适配体同时检测Hg2+和Pb2+示意图Fig.3SchematicrepresentationofsimultaneousdetectionofHg2+andPb2+usingaptamer钾离子是一种重要的生理指标离子，维持着细胞的正常功能，参与多种新陈代谢过程鍄与糖原和蛋白质合成有密切关系。钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的G-quadruplex二级构型并对此结构有一定的稳定作用，因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对钾离子的检测(见图4)[16]。水产品等间接摄入方式。Kim等人筛选出一种核酸适配体通过构型转换形成特定的二级结构用于绑定地下水中三价砷和五价砷，结合常数分别可达7nmol/L和5nmol/L[12]。Zhou等人通过核酸适配体和金纳米粒子利用比色法实