周建平-药品热原检查与细菌内毒素检查方法介绍

2019/8/171药品热原检查与细菌内毒素检查方法介绍北京市药品检验所药理室周建平2005年11月2019/8/172药品安全性检验内容热原检查（PyrogenTest)细菌内毒素检查（BacterialEndotoxinTest）异常毒性检查降压物质检查过敏法反应检查法降钙素生物测定法生长激素生物测定法溶血与凝聚检查法2019/8/173热原检查（PyrogenTest)热原的含义热原检查法基本原理热原检查法基本操作试验操作注意事项2019/8/174热原的含义热原系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。热原经静脉注入人体后15分钟即能产生强烈的发热反应，重者昏迷甚至危及生命。热原主要来源于革兰阴性菌的细菌内毒素。2019/8/175热原检查法基本原理被测物试验动物给药方法测定设备判断标准供试品溶液（输液、小针、粉针、注射用原料）家兔耳静脉注射肛温计或测温仪给药后体温变化2019/8/176试验基本原理家兔热原实验与人体的热原反应有什么样联系？1969年Greisman和Hornick研究比较了三种纯化内毒素对家兔和健康男性志愿者的反应，结果表明：人和家兔产生热原反应需要大约相同重量的细菌内毒素，但当热原的剂量增加时，人体反应较家兔更为强烈。2019/8/177热原剂量确定实验的设计是基于在不超过10分钟的时间内，给予家兔静脉注射使动物能够耐受的，不多于10ml/kg体重剂量的受试药物。《中国药品检验标准操作规程》2005版提出“供试品的剂量应按各该药项下的规定注射，未规定剂量的药品，可根据该药的药理性质，在不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算（人按50kg计），用临床一次剂量的3-10倍”家兔热原实验中的热原阈值剂量应当认为是最低标准，对于人体而言应尽可能的提高几倍实验的安全范围。2019/8/178热原检查法基本操作实验材料及设备实验准备实验动物实验环境供试液配制新兔预选家兔重复使用检查法结果判断（合格、复试、重做、不合格）2019/8/179实验材料及设备计量设备（天平、公斤称等）电热干燥箱（可达250℃以上）恒温水浴（37～38℃）家兔固定盒热原测温仪或肛温计（测温探头或肛温计）其它用品（7#针头、12#针头、注射器、直镊、配制容器、灭菌注射用水、氯化钠注射液、酒精棉球等）2019/8/1710实验准备热原测温仪或肛温计定期校验，符合计量认证的要求。实验用具的除热原处理：试验用注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，洗涤，干燥，250℃,30分钟以上。2019/8/1711实验动物动物品系：均为远交系动物，普通级饲养。日本大耳白（JapaneseWhite），新西兰白（NewZealandWhite），青紫蓝，比利时白（BelgianWhite），Chinchillas和DutchBelts要求：健康合格、1.7～3.0kg、同一来源和品系。性别:雌雄均可。雌性动物，比较温顺，易于捉持，体重增长较缓慢动物的检疫、标记：一周的检疫期，动物编号和笼具编号2019/8/1712实验环境实验室温度：17-25℃实验室与饲养室温差：≤5℃实验温度变化：≤3℃实验室：保持安静，避免强光、噪音等刺激，注意实验兔之间相互影响。2019/8/1713供试液配制1、固体样品注意称量、稀释时的操作，避免热原和其它污染。2、样品稀释时应注意准确性并尽量减少误差。3、配制时应注意含量或效价(抗生素）的折算问题以及总量是否够试验之用。4、稀释用的灭菌注射用水及氯化钠注射液宜经鲎试剂检查合格再用于稀释。2019/8/1714新兔预选1、新兔→饲养7日以上2、预测体温（条件同热原检查）：测温8次、间隔0.5小时。3、中选条件：体温在38.0～39.6℃，8次测温变化≤0.4℃（可供3周使用）2019/8/1715实验兔重复使用1、结果符合规定的实验兔，休息48hr2、复试用兔升温＜0.6℃且供试品合格，休息48hr3、使用次数未达10次的实验兔4、复试用兔升温≥0.6℃且供试品合格，按新兔测温合格（以上实验兔可重复使用）5、结果不符合规定的实验兔6、使用次数达10次的实验兔（以上实验兔不可再使用）2019/8/1716家兔重复使用美国药典27版仅仅规定了家兔使用频率，并没有规定年龄限制和重复使用长度，使用的频率规定不得超过每2天1次，若在热原实验中最大升温0.6度或更高，以及热原实验结果为阳性时，间隔时间不得小于2周。动物重复使用的长度在很大程度上取决于所检测的样品的性质，当家兔成熟时开始进入热原实验，至少可使用2年2019/8/1717检查法1、取合格兔，停食、停水，称重并固定约1小时2、每隔30分钟测温一次，致连续2次温差≤0.2℃，并算得2次均值为正常体温。3、及时配制供试液并预热至37～38℃4、选兔并分组（初试3只/组、组内温差＜1.0℃；复试5只/组）5、注射供试液（分组后15分钟内）6、计时开始并记录6次体温，间隔0.5小时，以6次中最高温度减去该兔正常体温为升温值2019/8/1718注射体积和注射速度通常给药剂量≤10ml/kg体重，并应在10分钟内完成注射。一般情况下，注射的速度和体积并不影响发热反应，大部分受试溶液可以在1-2min内注射完成，但部分受试产品具有明显和迅速的药理作用，可影响或干扰发热反应，需要缓慢进行注射2019/8/1719结果判断1、复试：初试3只兔中仅1只升温≥0.6℃或3只兔升温均小于0.6℃、但升温总和≥1.4℃，应另取5只复试。2、合格：初试3只兔升温均小于0.6℃且升温总和＜1.4℃；5只复试中仅1只升温≥0.6℃且初试、复试共8只兔升温总和≤3.5℃。3、不合格：初试3只兔中有2只升温≥0.6℃；复试5只中2只以上升温≥0.6℃；初试、复试共8只兔升温总和≥3.5℃。2019/8/1720内毒素发热的峰型呈典型的双峰型，前2小时内，先是持续15-18分钟的缓慢升温，随后是快速地达到高峰，经短暂的温度降低之后是第2个升温时相，经6-9小时后体温恢复到基线值。但当内毒素的量很高时，表现为快速的升温，没有典型的双峰型。2019/8/1721影响实验的其他因素导致发热减低药物不适合家兔热原实验，如：解热镇痛药物、催眠药物、局麻药物、吩噻嗪衍生物等。磷酸缓冲液和其他特异的缓冲液，即使不含有细菌内毒素，静脉输入足量的离子也可引起家兔热原样反应甾体激素和抗生素在许多哺乳动物可引起发热鲎试剂与细菌内毒素检查法2019/8/1723细菌内毒素检查相关理论及概念细菌内毒素鲎试剂鲎试剂与内毒素的反应机理细菌内毒素检查2019/8/1724细菌内毒素（细菌内毒素与热原的关系）热原（Progen）指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质。细菌内毒素（Endotoxin）革兰阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖（LPS）。热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但在GMP的条件下，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就控制热原。2019/8/1725细菌内毒素定义变化过去一直认为，细菌内毒素来源于革兰阴性细菌，但最近发现革兰阴性菌之外的其它菌中发现内毒素或内毒素样分子结构，如真核小球藻样绿藻。所有内毒素均为脂多糖（LPS），但并非所有的脂多糖均为内毒素，因为其不具有相关的毒性。如：肽聚糖、葡聚糖。2019/8/1726细菌内毒素的生物活性致热性引起血液中粒细胞下降激活凝血系统血压下降引起淋巴细胞的有丝分裂与鲎试剂反应2019/8/1727•广泛存在•非常稳定•其疏水末端非常易于自身或者与玻璃容器结合而聚集，而不是与水混合•致热活性的高度不均一性细菌内毒素的特征2019/8/1728细菌内毒素标准品的建立不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同，为保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上处于中值的位置，且其稳定、可溶，因此一般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素标准品。2019/8/1729标准内毒素标准内毒素：指经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检查的标准品。国际标准品（IS）标准品（RSE）国家标准品（RSE）标准内毒素工作标准品（CSE）2019/8/173080年代以前以重量作为内毒素的单位1982年USP20引入以生物效价为量值的内毒素单位（EU，EndotoxinUnit）细菌内毒素的量值2019/8/1731CP2000年版规定内毒素标准品溶解后要在旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀释前要至少混合30秒，其他国家药典也有类似要求；具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结果细菌内毒素标准品的稀释2019/8/17322019/8/1733鲎试验的发现1956年JohnsHophins大学动物学家Frederik.Bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚。1963～1964年Jack.Levin和Bang对细菌引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应。多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行研究，阐释了凝聚机制2019/8/1734鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成鲎试剂的种类：依据鲎的种类分：美洲鲎试剂（LAL）中国鲎试剂（TAL）圆尾鲎试剂（CAL）依据检查方法分：凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分：普通鲎试剂和特异性鲎试剂鲎试剂与分类2019/8/17352019/8/1736灵敏度自身凝集缓冲能力水分微生物检查鲎试剂的质量控制指标2019/8/1737C因子活化的C因子内毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反应）G因子二价阳离子凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理——复杂的酶促反应过程2019/8/1738美国和中国BET发展历史1991部颁标准规定了4个品种采用细菌内毒素检查方法，结果阳性时以家兔热原检查法判定。1993年中国药典第二增补本开始收载该法1995年附录收载了经修订的细菌内毒素检查法，正文收载了13个品种。2000年收载69个品种，并收载了《细菌内毒素检查法应用指导原则》2005年版改热原73品种，增订112品种，共计252个品种USP24版收载680多品种进行内毒素检查，保留热原检查的药品不足30种2019/8/1739国内鲎试剂的生产情况安度斯生物技术有限公司湛江海洋生物制品厂福州新北鲎试剂厂厦门鲎试剂厂福州东方鲎试剂厂福州平潭东方鲎试剂厂广西北海鲎试剂厂2019/8/1740细菌内毒素检查法的目的和前提确保药品不含有能导致患者发热反应发生的足量的细菌内毒素。一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是SFDA允许的。前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是内毒素。2019/8/1741细菌内毒素检查法凝胶法光度测定法浊度法（终点浊度法和动态浊度法）显色基质法（终点显色法和动态显色法）2019/8/1742凝胶法最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法对干扰相对不敏感。有两倍的误差较光度测定法不灵敏2019/8/1743光度测定法灵敏（动态浊度检测限0.001EU/ml，动态显色0.005EU/ml）检测范围宽（动态浊度达到100EU/ml,动态显色50EU/ml）较之凝胶法易受干扰对结果的解释更慎重。2019/8/1744一、凝胶法（一）检查法的描述（二）实验准备实验器械的要求检查用水的要求工作标准品稀释制备供试品的制备（三）实验部分鲎试剂灵敏度复核干扰实验检查法：限量试验半定量试验2019/8/17