荧光免疫标记技术

任务八荧光免疫标记技术知识目标技能目标素质目标1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在医学检验中的应用2.熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器和设备3.了解荧光抗体的制备1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备2.会用荧光免疫技术检测抗原抗体3.能将荧光免疫测定与临床应用相联系通过学生相互鼓励、严谨、认真操作，各小组共同协作完成任务，培养了与人合作、与人沟通的能力任务目标1荧光标记物的制备2荧光免疫组织化学技术3其他荧光免疫技术任务对象任务过程复习提问案例导入讲解与示教学生操作讨论分析评价、考核课后思考题教学环节2′30′2′10′40′5′1′患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽3天。体温最高39度，病程第2天查血常规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？案例导入老师纠正点评学生操作一位学生操作演示学生分组再操作【主要试剂与器材】1.抗原基质片固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。2.标记抗体FITC标记的羊抗人IgG，有商品化试剂供应。临用时稀释至工作浓度。3.0.01mol/LpH7.2PBS。4.缓冲甘油9份甘油和1份PBS混匀。5.待检血清，阴性、阳性对照血清。6.其它荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。实验操作【操作方法】1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈标记。2.将待检血清和对照血清用PBS作1∶10稀释，用微量加样器加50μl待检血清或对照血清于基质片上，水平置于湿盒中37oC温箱反应30min。3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸中，反复漂洗3次，每次5min。4.取出玻片，吹干，加50μl最适工作浓度的标记抗体，平置于湿盒内，37oC温箱反应30min。5.重复步骤3，洗去未结合的荧光抗体。6.滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。实验操作【结果判断】1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；反之为阴性。2.根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：⑴均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。⑵周边型:细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或无荧光。⑶斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。⑷核仁型：核仁部分呈现荧光。实验操作实验操作【注意事项】1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内，防止干燥。2.每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。3.荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注意低温避光保存。实验操作【应用与评价】荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测，免疫细胞表面抗原的检测等。此方法检测ANA，主要用于初步筛查，具有简便、快速、敏感等特点。实验操作讨论分析提出问题展开讨论用什么可以观察到荧光？为什么有荧光就能做出诊断？免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。该技术的主要优缺点主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。免疫荧光技术讨论分析免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。免疫荧光技术-基本原理讨论分析荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。发生原理---基态激发态产生特点：激发---即刻产生停止激发---瞬间消失种类---光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光讨论分析荧光荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光衰减到一定程度所用时间。荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后发生的减弱现象。淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等荧光（标记）物质的保存荧光讨论分析荧光色素:能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。讨论分析异硫氰酸荧光素(FITC)荧光FITC+RB200标记讨论分析光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯1滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、吸收滤板（OG、GG）2光路：透射光、落射光荧光显微镜讨论分析a透射光b落射光讨论分析荧光显微镜台式机---FACSCalibur双激光---488nm635nm四荧光参数分选、浓缩系统讨论分析大型机---FACSVantageSE多激光多波长八荧光参数高速分选单细胞点对点分选讨论分析基本原理---荧光显微镜；荧光Ab；标本（组织或细胞中Ag)技术类型：直接法---荧光素标记Ab直接检测间接法---荧光素标记二抗补体结合法---荧光素标记抗补体Ab双结合法---两种荧光素标记Ab重点荧光免疫显微技术讨论分析讨论分析间接免疫荧光检测自身抗核抗体讨论分析FALSSensorLaser前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小荧光免疫显微技术讨论分析FALSSensor90LSSensorLaser侧向角散射光（SSC）：反映细胞内的颗粒多少荧光免疫显微技术讨论分析双色直接染色细胞T细胞B细胞荧光免疫显微技术讨论分析直方图分析：对细胞的某一个单参数进行统计分析横坐标为荧光或散射光强度纵坐标为细胞数荧光免疫显微技术讨论分析间接免疫荧光法示意图讨论分析荧光免疫显微技术在医学检验中的应用：细菌检验---细菌培养物、感染组织、病人分泌排泄物等（菌种鉴定）病毒检验---特殊意义亦可检测血清中Ab(间接法)---流行病学调查和临床回顾性诊断寄生虫检验---间接法测Ab,如抗疟Ab、阿米巴Ab等自身Ab检测讨论分析配分与评分标准序号考核要点分值评分标准得分12(1)抗原基质片，平衡至室温(2)记号笔画圈标记(1)待检血清和对照血清用PBS作1∶10稀释(2)微量加样器50μl待检血清或对照血清于基质片上⑶水平置于湿盒中37oC温箱反应30min11111不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除考核配分与评分标准序号考核要点分值评分标准得分3⑴以PBS冲洗抗原基质片(2)浸于盛有PBS染色缸中⑶反复漂洗3次⑷每次5min111不符合要求将此分扣除考核配分与评分标准序号考核要点分值评分标准得分4⑴取出玻片，吹干(2)加50μl最适工作浓度的标记抗体⑶平置于湿盒内，37oC温箱反应30min111不符合要求将此分扣除考核序号考核要点分值评分标准得分56⑴重复步骤3，洗去未结合的荧光抗体(1)滴加缓冲甘油封片⑵用荧光显微镜观察1111不符合要求将此分扣除不符合要求将此分扣除考核配分与评分标准姓名、班级和学号实验题目实验原理（略写）实验操作（略写）实验结果画图文字描述分析和讨论思考题实验报告