荧光分析法

当某些物质分子被光照射时，会吸收某些波长的光，然后再发射出波长更长的光，当照射光停止时，发射光也随之消失，这种光致发射光叫做荧光。荧光分析法就是利用荧光物质分子所发射的荧光的特性和强度来进行定性定量分析的方法。分子荧光分析法（molecularfluoresceneanalysis,MFA）正在朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，其灵敏度、准确度和选择性日益提高，应用范围工业、农业、医药卫生、环保、刑侦和科学研究领域。1.基本概念2.基本原理E0是基态能级，E1是第一电子激发态能级；V是振动能级无辐射跃迁不会发光：某些特定结构（如π-π共轭体系）的分子，当处于基态能级的分子吸收了一定频率的光，便被激发至其电子激发态能级的某个振动能级，然后通过相互碰撞或和其他分子（如溶剂分子）碰撞消耗振动能级间的能量，急剧降至第一电子激发态的最低振动能级当第一电子激发态的最低振动能级继续下降至基态的各个不同的振动能级时，则以荧光的形式发出能量。较高的基态振动能级的分子在经过分子之间的碰撞失去部分能量回到最低基态振动能级。相对于基态和激发态两个最低振动能级之间的跃迁所产生的荧光称为共振荧光。•射线的频率ν、波长λ以及其光子的能量E、动量p之间存在如下关系：hchEhp式中:h——普朗克常数，等于6.626×10-34J·s;c——光速，等于2.998×1010cm/s.在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，常用电子自旋状态的多重性来描述。一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示，基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0表示如果电子在跃迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子，这样的电子态称为三重态，用T表示基态单重态S三重态TE当激发态分子返回基态时，如果不伴随发光现象，此过程称为无辐去激，它包括振动弛豫、内转换、系间窜跃无辐射跃迁振动弛豫内转换系间窜跃处于S1或T1态的分子返回S0态时伴随发光现象的过程称为辐射去激辐射去激荧光磷光分子荧光：分子从S1态或T1态的分子返回S0态各个振动能级所发生的辐射光称为荧光，他是相同多重态间的允许跃迁，其概率大，辐射过程快，一般在10-9~10-6s内完成，因此也叫快速荧光或瞬时荧光。分子磷光：当受激分子将至S1的最低振动能级后，经系间窜跃至T1态，并经T1态的最低振动能级回到S0态的各振动能级所辐射的光称为磷光。磷光的寿命约为10-4~10s，光照停止，仍可持续一段时间基态：电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2…表示激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2….表示。三重态能级低于单重态（Hund规则）•荧光效率（fluorescenceefficiency):指激发态分子发射荧光的分子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用f表示吸收激发光的光子数发射荧光的光子数f荧光效率大，表示分子产生的荧光能力越强，f值在0~1之间。喹啉的荧光强度十分稳定，可作为基准物质，硫酸喹啉（0.5mol/L）溶液的荧光效率φ=.055荧光条件：1.分子必须有产生电子吸收光谱的特征结构2.较高的荧光效率。许多物质不产生荧光，就是由于该物质吸光后的分子荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗于与溶剂分子或其他溶质分子之间，因此无法产生荧光。溶液的荧光强度F与该溶液吸收光强度Ia以及物质的荧光效率φ成正比F=φIaI0IF)(0IIFIa根据朗伯比耳定律EClII100)1()101(3.200EClECleIIF=2.3φECl·I0当入射光强度I0和宽度l一定时，则F=K·Cex-1~x垂直荧光强度F与溶液浓度C成正比，荧光定量分析的基本依据结论：荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液(ECl0.02)。对于较浓溶液，会产生自熄灭现象。F=K·C由F=2.3φECl·I0可知，由于荧光强度和入射光成正比，因此增加I0可以提高分析灵敏度。荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。1.溶剂的影响•荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大而增强。•2.溶液粘度的影响•荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果影响荧光强度的因素3.温度的影响荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。4.溶液pH的影响溶液pH值得改变会明显影响带有酸性或碱性官能团的荧光物质的荧光强度，因此荧光分析中应严格控制溶液pH值。NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+无荧光无荧光蓝色荧光5.荧光的猝灭由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用，引起荧光强度降低的现象，称为荧光的猝灭。引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂。荧光物质浓度大时，还经常发生自猝现象碰撞猝灭M+hv→M*,M*+Q→M+热静态猝灭M+Q→MQ非荧光物质转入三重态的猝灭三重态荧光物质的自猝灭荧光物质浓度较高荧光分析法所使用的仪器叫荧光计（fluorometer）。荧光计又分为简单的光电荧光光度计和复杂的荧光分光光度计。它们通常由激发光源、单色器、样品池、检测器和放大显示系统等部分组成。仪器组成光源激发单色器样品池发射单色器检测器放大器指示器·记录器垂直国产970CRT型荧光分光光度计荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在220~700nm之间。1.激发光源在荧光光度计中使用滤光片充当单色器。大多数荧光分光光度计都采用光栅或棱镜单色器。一般有两个单色器，一是激发光单色器，其作用获得单色性较好的激发光，以激发样品产生荧光；另一是发射光单色器，其作用在于分出某一波长的荧光，以减少干扰。2.单色器荧光分析所用样品池需用低荧光、不吸收紫外线的石英材料制成，形状以正方形、长方形为宜，也有用圆形的3.样品池4.检测器荧光的强度很弱，因此要求检测器有较高的灵敏度。荧光分光光度计一般采用灵敏度高的光电管或光电倍增管做光电转换元件，为了消除激发光对荧光测量的干扰，在仪器中，检测光路与激发光路相互垂直。荧光分析法可用于对荧光物质进行定性和定量分析。荧光定性分析可采用直接比较法，即将试样与已知物质并列于紫外线下，根据他们所发出荧光的性质、颜色和强度，来鉴定他们是否含有同一荧光物质。但由于许多化合物几乎在同一波长下产生光致发光，所以荧光分析法很少用作定性分析。目前荧光分析法主要用于对无机和有机化合物的定量分析。荧光分析法应用•步骤：•1.配制不同浓度的标准•溶液•2.做F～C关系曲线•3.求得浓度定量分析方法1.校正曲线法CF校正曲线注意：固定仪器和测定条件；试样浓度在线性范围内如果荧光物质的校正曲线通过零点，就可以在线性范围内用标准对照法测定含量。具体做法是：在相同的条件下，测定试样溶液和标准溶液的荧光强度的比值和标准溶液的浓度就可以试样中荧光物质的含量。2.标准对照法XSXSCCFF注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内1.直接荧光法主要依赖于待测元素与有机试剂组成能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度来测定该元素的含量。较常用荧光法分析的元素为铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素2.间接荧光法某些阴离子如F-、CN-等，他们可以从某些不发荧光的金属有机配合物中夺取金属离子，而释放出发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量无机化合物的分析3荧光猝灭法有些元素虽不与有机试剂组成会发荧光的配合物，但它们可从其他会发荧光的金属离子-有机试剂配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致荧光强度降低，由降低的程度测定该元素的含量。该法可以测定氟、硫、铁、钴、镍、铜、钨、钼、锑、钛等元素和氰离子4.催化荧光法某些虽能产生荧光，但反应速率很慢，荧光微弱，难以测定。若在某些金属离子的催化作用下，反应将加速进行，利用这种催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量。可以测定铜、铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铅、钛、钒、锰、过氧化氢及氰离子1.脂肪族化合物脂肪族化合物的分子结构简单，本身产生荧光的很少。但许多脂肪族化合物与某些有机试剂反应的产物具有荧光性质，此时可测量荧光化合物的荧光强度进行定量分析。2.芳香族化合物芳香族化合物具有共轭不饱和结构，大多能发荧光。可以直接进行测定。氨基酸、蛋白质、维生素、胺类、甾族化合物（胆固醇、激素）、药物、毒物、农药以及酶和辅酶等，大多数具有荧光，可用荧光分析法测定研究其结构和作用机理。在现代分离技术中，以荧光法作为检测手段，常可以测定这些物质的低微含量。有机化合物的分析举例利用荧光检测的方法快速检测城市污水对饮用水影响的研究荧光光谱收集主要采用安捷伦卡里荧光分光光度计（米西索加，加拿大）。处理厂1样品使用珀金埃尔默ls50b荧光分光光度计分析（Woodbridge，加拿大）。最佳的仪器设置进行了测定，根据以前的研究和内部测试。激发和发射波长范围分别为250至380纳米（10纳米的增量），和250至600纳米（1纳米的增量）。与既定的仪器设置，一个样品的数据采集约13分钟。一旦建立了预测模型，在线荧光系统的反馈将是有限的样本采集时间。在这种情况下，我们保持了仪器设置，使得样品迅速获得在15分钟内。一系列的Milli-Q®收集水作为参考和减去从每个样品光谱考虑溶剂的影响。拉曼校正施加的激发波长为350纳米和5纳米的带宽，以表征在拉曼单元的荧光强度。过滤和校正内过滤器的影响并没有进行，由于在线实施的方法和要求附带的在线紫外分析仪的限制。howevernomatchwasfoundforC3.Withexcitation/emissionmaximaat340/412nm,C3conformstohumic-likefluorescence但是没有找到匹配的C3。激发/发射在340／412处的最大值，C3符合腐殖质样荧光大豆蛋白水解物组分的荧光光谱和主成分分析及其抗氧化能力的研究包含两个区域代表氨基酸的物质（峰值α和肩膀δ）和一个区域对应的瑞利光散射（卢比）。由α和δ确定的荧光区域分别代表色氨酸和酪氨酸（Baker，2002；克里斯坦森等，2006）。在色氨酸荧光激发/发射275纳米/350纳米，和酪氨酸激发/发射275纳米/305纳米（Baker，2002）。相应的RS区与水中的胶体物质相关（佩里斯，布德曼，etal.，2010）荧光特性中观察到典型的荧光的EEM（a）渗透（0.076毫摩尔G1；肽含量TS20.2gL1）和（b）纳滤透过液在pH8（0.125毫摩尔G1；肽含量TS0.4gL1）与热处理大豆蛋白水解物。由α和δ确定的荧光区域分别代表色氨酸和酪氨酸。瑞利光散射（遥感）区域表示的虚线