酶工程 第八章 酶的定向进化 (1)

蛋白质与酶工程Chapter8EnzymaticDirectedEvolution第八章酶的定向进化3•微生物发酵产酶(Chap.2)酶工程：酶（酶制剂）的生产、改性和应用的技术过程。生产改性应用•动植物细胞培养产酶(Chap.3)•酶的提取与分离纯化(Chap.4)•酶分子修饰(Chap.5)•酶/细胞/原生质体固定化(Chap.6)•酶定向进化(Chap.8)•酶非水相催化(Chap.7)•酶反应器(Chap.9)•酶的应用(Chap.10)4物种的自然进化5定向进化（directedevolution）•自然进化•定向进化随机突变自然选择人工随机突变人工定向选择Vs.基因的定向进化蛋白的定向进化酶的定向进化细胞的定向进化。。。6酶的定向进化•理性设计rationaldesign•定向进化找出酶的关键结构，有目的地改造不需要事先知道酶的空间结构、活性位点等Vs.7酶的定向进化•基于序列的理性设计：分子修饰利用已知酶分子的空间结构、结构和功能之间关系，以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造；•利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，并定向筛选出所需突变酶；8酶的定向进化酶定向进化的概念：模拟自然进化（随机突变和自然选择）的过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，并在人工控制条件的特殊环境下进行定向选择，得到具有优良催化特性的酶的突变体。所得到的酶称为进化酶。9酶的定向进化•主要过程：1、随机突变（产生基因多态性）2、构建突变基因文库（将突变基因与适当的载体重组）3、突变基因的筛选（获得正突变）Contentsofchapter88.1酶基因的随机突变8.2构建突变基因文库8.3突变基因的筛选8.4酶定向进化的应用118.1酶基因的随机突变随机突变的技术•无性突变技术：易错PCR(error-pronePCR)•有性突变技术：DNA改组(DNAshuffling)交错延伸PCR随机引物体外重组基因家族重排12PCR131、易错PCR•Taq酶不具有3’5’方向的外切酶活性，有一定的错配几率（5×10-5）•易错PCR：提高PCR过程的错配几率141、易错PCR方法：•改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降至5％-10％），同时加入dITP来代替被减少的dNTP；•缓冲液中另加0.5mmol/LMn2+•提高Mg2+浓度151、易错PCR•优点：操作简便，随机突变丰富；•缺点：正突变概率低，突变基因文库较大，文库筛选工作量大；适用于较小基因的定向进化•难点：要控制好突变率161、易错PCR连续易错PCR：将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。172、DNA改组(DNAshuffling)•DNAshuffling：•从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用DNAI酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，获得重新排列的突变DNA的过程。18有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)正突变19DNA重排原理图（1994，Stemmer)1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段20DNAshufflingHowDNAshufflingisdoneinthetubeRandomfragmentationofapoolofrelatedgenes;Self-primingpolymerasereactionandtemplateswitching(causingcrossovers);PCRamplificationwithprimersofreassembledproducts21DNAshuffling方法：从正突变基因库中分离得到的DNA序列用酶随机切割，得到的随机片断经不加引物的多次PCR循环，获得全长基因，实现优势突变的组合；特点：遗传变化仅发生在来自不同基因片断之间的重组，所以称为有性进化；优点：将已有的正突变基因结合，正突变效率高；缺点：无引物PCR之前必须把DNaseI去除干净，以防突变基因的被切割；22不需加DNAI的DNA重排技术•交错延伸PCR•随机引物体外重组技术23交错延伸PCR(1997,Arnold)•Staggerextensionprocess,SEP•在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而交替延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。24交错延伸PCR突变法将常规的退火和延伸合并成一步，缩短反应时间25随机引物体外重组(1998,Arnold)•RPR(Random-priminginvitrorecombinatoion)•在以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段。•去除模板后，在随后的PCR反应中，它们互为引物和模板进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。2627基因家族重排技术（1998,Crameri）•单一酶分子基因：进化过程中集中有利突变速度较慢•基因家族：由于基因之间存在显著差异，所得突变库体现了基因多样性和增加了有利突变的概率•由于定向进化的高效性，被认为是DNA改组的发展方向28单基因重排Vs基因家族重排技术Similarmutantsgeneratedbyerror-pronePCR,randomandsite-directedmutagenesis...........SinglegeneshufflinglibraryofpointmutantsFamilygeneshufflinglibraryofchimerasGeneratingchimeraswithcrossoversoflargeblocksofsequencesContentsofchapter88.1酶基因的随机突变8.2构建突变基因文库8.3突变基因的筛选8.4酶定向进化的应用308.2突变基因文库的构建定向选择：•先把随机突变获得的突变基因做成基因文库，再从中筛选出有用的突变基因。318.2突变基因文库的构建•文库的包容性：足够大容量，利于之后筛选的全面•文库的完整性：足够完整的DNA片段，利于之后筛选出完整的进化酶328.2突变基因文库的构建过程：•载体的选择（质粒、噬菌体载体、黏粒质粒、噬菌体质粒）•基因重组（酶切+连接）•形成基因文库（转化或转染）Contentsofchapter88.1酶基因的随机突变8.2构建突变基因文库8.3突变基因的筛选8.4酶定向进化的应用34•目标•根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从突变基因文库中得到所需的突变基因。•难点•突变库容量大，一般达到106，工作量巨大•关键•高通量筛选：通量大，效率高•方法平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法8.3突变基因的筛选358.3突变基因的筛选•（一）定向选择环境条件的设立•例：为提高酶的热稳定性，可以在较高的温度下培养重组细胞，并在每一次“突变－筛选”的循环中逐步提高培养温度368.3突变基因的筛选•（二）高通量筛选：通量大、效率高，可迅速判断哪些是正突变平板筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法酵母细胞表面展示法378.3突变基因的筛选1、平板筛选（1）依据细胞生长情况筛选•热稳定性：温度梯度和高温环境•抗生素耐受性：抗生素浓度梯度•pH稳定性：pH梯度•极端环境：高盐、低温、高浓毒物质381、平板筛选方法（2）依据颜色变化筛选反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚脂肪酶筛选39（3）依据透明圈大小筛选淀粉酶的进化：淀粉平板培养基豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基1、平板筛选方法402、荧光筛选法41利用自身荧光激发特性生成产物本身是具有荧光激发特性的物质利用荧光报告基因辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因：原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光）绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖2、荧光筛选法422008年诺贝尔化学奖介绍获奖2008年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人因为在绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究和应用方面做出的突出贡献将各分得2008年度1／3的诺贝尔化学奖奖金。432008年诺贝尔化学奖介绍评论生物学有些现象只能在打碎细胞以后才能做，所以实际上是从“死物”上来推测生物的情况。而下村修、钱永健和马丁·沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象。所以，可以说是把一些“死物学”变成了真正的“生物学（北大饶毅）绿荧光水母—通过体内绿色荧光蛋白发光科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质44绿色荧光蛋白的应用分子标记：GFP标记的微管结构453、噬菌体表面展示法利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术464、酵母表面展示法•通过锚定在酵母细胞表面的特点蛋白质与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物，使外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分子展示技术。•凝集素Contentsofchapter88.1酶基因的随机突变8.2构建突变基因文库8.3突变基因的筛选8.4酶定向进化的应用