转录水平检测甲胎蛋白

医学分子生物学第四次讨论课医学分子生物学AFP的来源及生化特性AFP测定的临床意义从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测医学分子生物学AFP的来源及生化特性甲种胎儿球蛋白（alpha-fetoprotein或α-fetoprotein,AFP或afp）。AFP是啮齿类动物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。人类胚胎在宫内发育的第六周左右用双向扩散法即能测出AFP，到第13周左右可达到高峰，第16周后AFP的浓度迅速下降而白蛋白浓度上升。在人类胚胎中AFP最高浓度可达3—4mg/ml，但新生儿期其血清浓度约为10－50ug/ml，出生后第1周末用双向扩散法即不再能测出，然而用敏感的方法测定，证明AFP可持续存在于正常成人的血清中。AFP的合成部位主要是在啮齿动物及人类胚胎的肝脏，但也可在卵黄囊及胃肠道等。人类的AFP属于α球蛋白，分子量约为64,000—72,000。此蛋白约有18种氨基酸组成，碳水化合物约占4%。医学分子生物学AFP测定的临床意义诊断原发性肝癌。检测AFP的含量是诊断原发性肝癌的重要手段之一，由于肝癌的癌细胞能合成或分泌较多的AFP释放入血的缘故。正因为如此，医生们就把检测人体血液中的AFP作为诊断肝癌的重要依据，并把AFP称为“肝癌标志物”。检测AFP是诊断肝癌的一种简便、灵敏、快捷的方法，现认为它在发现早期肝癌方面有独一无二的价值，用AFP诊断肝癌的“专一性”仅次于病理学检查。血清AFP升高，还可出现于畸胎瘤、睾丸和卵巢肿瘤等。急性肝炎和肝硬化的鉴别诊断肝细胞再生时期，AFP在血液中呈阳性，急、慢性肝炎、肝硬化时会有肝细胞再生，因而AFP在血液中的浓度升高。一般急性肝病，可随病情好转AFP含量下降或正常，肝硬化可呈下降或持续低水平，肝癌则逐渐上升。先天性疾病的诊断先天性疾病的诊断：检测羊水中AFP含量的意义已引起注意，Rendle用放射免疫法检测，发现无脑儿羊水中含量显着升高。正常妊娠12～16周羊水AFP含量为21.1±1.2mg/L，以后逐月下降，足月时为0.5±0.2mg/L。无脑儿患者在妊娠26～31周为95.7±19.3mg/L，32-38周为25.7±5.9mg/L。先天性肾病及脊柱裂也有类似报道。因此用放免法检测羊水中AFP含量，有助于某些先天性疾病的出生前诊断。母体血中AFP升高还可见于异常妊娠，如：胎儿有脊柱裂、无脑儿、脑积水、十二脂肠和食道闭锁、肾变性、胎儿宫内窒息、先兆流产和双胎等。医学分子生物学甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关。01020304实验目的实验方法及原理技术路线可能的结果分析及应用从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测医学分子生物学肝癌细胞的血源性播散是原发性肝癌肝外转移的主要方式，定量检测AFP(alpha—fetoprotein)mRNA可早期发现外周血的肝癌细胞，不仅对判断肝癌的转移、复发具有重要价值，而且对指导临床制定治疗措施亦有重要意义。通过提取肝癌病人的外周血，根据mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测。取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者与非癌性肝病患者作为对照组。医学分子生物学通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成cDNA，利用实时荧光定量PCR技术，测定AFPmRNA的丰度。实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过内参或者外参法可对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。医学分子生物学一、实时荧光定量PCR（FQ-PCR）01荧光染料02荧光共振能量转移03PCR扩增及其监测04实时荧光定量PCR定量原理05实时荧光定量PCR优缺点医学分子生物学荧光基团通常各有单一的的光吸收峰，荧光基团吸收激发光的能量后通常以3种方式释放出能量。（1）光能（2）热能（3）转移给邻近的分子01荧光染料医学分子生物学当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽（猝灭）。02荧光共振能量转移医学分子生物学荧光PCR的独特之处在于PCR过程中利用荧光染料在激发光下释放的荧光能量的变化直接反应PCR扩增产物量的变化。由于荧光信号变量与扩增产物变量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光进行采集和分析，能够实现对PCR过程的检测，达到对原始模板定量的目的，主要采用以下数种模式：03PCR扩增及其监测01仿溴乙錠着色监测02荧光标记引物03荧光标记探针医学分子生物学04实时荧光定量PCR定量原理1.几个基本概念01020304基线荧光阈值的设定Ct值05S型扩增曲线熔解曲线医学分子生物学是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（本底信号是指没有进样时检测器的信号值，与检测器的类型有关，是无论如何也去不掉的值。测试的结果是在本底值之上增加多少的），荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。04实时荧光定量PCR定量原理基线荧光阈值的设定C代表循环数、t代表域值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，而所涉阈值都很低。Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没有被放大，所以具有良好的重现性。Ct值医学分子生物学PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所作的曲线。S型扩增曲线04实时荧光定量PCR定量原理医学分子生物学Ct与起始模板量的对数呈反比，即Y=-aX+b，其中X为浓度值对数值，Y为Ct值。PCR扩增包含定量对照，即引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，配合使用PCR扩增与荧光检测合二为一的仪器，利用该系列模板Ct值与已知浓度对数作直线回归得到标准曲线，从而计算出位置样品的起始模板浓度。这种定量分析摒弃对PCR终产物的测定，通过监测PCR过程中荧光强度的连续变化，用准确表征PCR对数增长规律的Ct值进行循环实时分析。04实时荧光定量PCR定量原理医学分子生物学固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数呈反比。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线：横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得位置样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数（起始拷贝数就是指某基因(可以是质粒)在某一生物的基因组中的个数.单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个,多则指有多个）。04实时荧光定量PCR定量原理医学分子生物学荧光PCR融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术的定量精确性，具有以下的优点：05实时荧光定量PCR优缺点优点1）封闭反应，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，污染因素少，且无需PCR后处理。2）灵敏度高，假阳性率低，荧光标记探针的最大优点在于其特异性非常强，避免了非特异性扩增造成的假阳性信号。3）采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。7）操作安全快速4）定量范围宽，可达到10个数量级。5）计算机同步跟踪，数据化自动处理，在线实时监测，结果直观，避免人为判断。8）利与自动化和联网管理6）效率高，可用多种商品画荧光物质，如TET、FAM、HEX、JOE等作为报告荧光（3’端的猝灭基团常用TAMRA），实现一管双检或多检。医学分子生物学扩增的循环数越靠后，定量的重复性越差，可能有以下主要原因：1)荧光定量技术要求在低分子浓度环境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立起来的。如果分子浓度过高，影响作用复杂，而PCR扩增产物时高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。2)由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。05实时荧光定量PCR优缺点缺点医学分子生物学二、TaKaRaOneStepSYBRQRT-PCR试剂盒医学分子生物学01制品内容医学分子生物学原理：本制品利用反转录酶PrimeScriptRTase将RNA反转录成cDNA，在以cDNA为模板利用TaKaRaExTaqHS在同一反应管内连续进行RT-PCR扩增反应（利用SYBRGreenI嵌合荧光法）。采用如图所示的OneStepRT-PCR方法，反转录以总RNA为模板，利用反应引物合成cDNA，在以此为模板，利用引物进行PCR扩增反应。01制品原理医学分子生物学用TRIzol试剂盒提取RNATRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。医学分子生物学医学分子生物学医学分子生物学医学分子生物学引物、探针的设计和合成应用生物信息学知识,从基因库中查阅出AFP的DNA和mRNA序列。根据引物设计原则,并利用PrimerExpress2.0设计软件,设计出扩增AFPmRNA基因片段的上下游引物和探针。PCR实验成功的最关键环节就是引物的设计。甲胎蛋白DNA序列医学分子生物学引物、探针的设计和合成上游引物序列:5’--TGGGACCCGAACTTTCCAAG--3’下游引物序列:5‘--CCTGCAGACAATCCAGCACAT--3’探针序列：5’--TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT--3’医学分子生物学RT-PCR扩增AFPmRNA用上述提取的的总RNA,进行逆转录PCR。反应体系:主要包含上下游引物、各种酶、底物、模板和Mg2+5种物质。现在以TaKaRaOneStepSYBRQRT-PCR试剂盒为例作为整个反应体系。反应条件:针对不同的引物，设定最佳的退火温度是QRT-PCR反应顺利进行的关键。具体反应程序包括反转录、预变性、变形、退火、延伸等。所有过程的反应温度和作用时间均应经过筛选确定最佳反应条件。具体反应条件的参考值见表1，可在参考值范围内加减选择最佳条件。根据扩增片段长度,扩增产物用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下割取特异性的条带,用QIAquickGelExtractionKit(德国Qiagen公司)试剂盒（用于纯化DNA）进行纯化。医学分子生物学标准曲线的制作用RNaseFreedH2O（用于溶解难溶于水的RNA）将总RNA稀释到0.2μg/μl，作为浓度最高的模板（20,1号）。然后取11个容量为150μl的离心管（2~12号），分别加入10μlRNaseFreedH2O。从1号管中取10μl加到2号管中，稀释倍数为1。以此类推，如图所示，将1号主机2倍稀释成，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11，用于标准曲线的制作。医学分子生物学标准曲线的制作将倍比稀释的总RNA作为QRT-PCR标准曲线的模板，应用确定的最佳反应条件，进行实时荧光定量PCR扩增，系统根据荧光值的变化规律生成标准动力学曲线、熔解曲线、和标准回归曲线。医学分子生物学标准曲线的制作熔解曲线上应该有且只有一个明显的峰，扩增产物的Tm值须非常均一，表明没有产生非特异性扩增产物及引物二聚体。医学分子生物学标准曲线的制作医学分子生物学结果肝癌患者与对照组的外周血中AFPmRNA的表达水平有显著差异。医学分子生物学应用AFPmRNA由有活性的肝癌细胞表达,坏死后脱落入血的肝癌细胞不可能有mRNA的表达,即使肝脏癌组织直接释放少量裸露的AFPmRNA,也会被