基于基于抗原-抗体反应的检测方法

免疫学检测原理第一节基于抗原-抗体反应的检测方法学习目的：一、掌握抗原-抗体结合反应的特点二、了解影响抗原-抗体反应的因素三、学习抗原-抗体反应的基本检测方法抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。主要应用：用已知抗原检测未知抗体用已知抗体检测未知抗原定性或定量检测体内各种大分子物质用已知抗体检测某些药物、激素和炎性介质等各种半抗原物质一、抗原-抗体结合反应的特点高度特异性定义：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。分子基础：抗原表位与抗体的抗原结合部位间存在分子结构的互补性，二者可特异性结合。交叉反应共同抗原决定基刺激机体产生的抗体分别与两种抗原(共同抗原)结合发生反应。机理：具有相同的抗原表位抗原-抗体结合的带现象与可见性A.前带现象：抗体过剩B.后带现象：抗原过剩C.网格复合体：抗原、抗体的数量比例合适。反应体系基本不存在游离的抗原或抗体，形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。可逆性抗原-抗体反应为分子表面的非共价键结合，结合虽稳定但可逆。过剩方结合价未被完全占据，成游离小分子复合物或解离，不可见二、抗原-抗体反应的影响因素内因：1）抗体的特异性和亲和力2）抗原理化性质、抗原表位多寡和种类3）抗原抗体的浓度、比例（影响最大，决定因素）外因：1）电解质使抗原-抗体复合物失去电荷而凝集，出现可见反应2）酸碱度最适pH6～83）温度适宜（可增加抗原与抗体的碰撞机会，加快结合速度）三、抗原-抗体反应的基本检测方法凝集反应：细菌或红细胞等颗粒性抗原与相应抗体直接反应出现凝集。沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀。补体参与的反应：应用抗体与红细胞表面抗原结合，激活反应体系中的补体成分，根据溶血现象判定试验结果。免疫标记技术：用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测.单向免疫扩散：特点：定性半定量用途：可用于测定血清IgGIgMIgA和C3等的含量原理：沉淀环的直径与抗原含量呈正相关操作：铺板↓打孔↓加样↓放湿盒↓看结果双向免疫扩散用途：鉴定两种抗原是否相同特点：定性半定量操作：铺板↓打孔↓加样↓放湿盒↓看结果免疫电泳常用于血清蛋白的组分分析在一定量的抗体中，分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并与一系列标准品对照，由此推算样品中的抗原含量。免疫比浊原理：抗体浓度（高浓度）固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。免疫标记技术：（1）免疫荧光法（2）酶免疫测定（3）放射免疫测定法（4）化学发光免疫分析（5）免疫印迹法（1）免疫荧光法优点:特异性高缺点:检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。间接荧光法优点:敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测。缺点：非特异性反应亦增强。直接荧光法荧光素与抗体连接，再与抗原反应（对抗原定性或定位）（2）酶免疫测定将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。酶联免疫吸附试验(ELISA)：测定可溶性抗原或抗体。免疫组化技术：应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。双抗体夹心法间接法酶联免疫斑点实验ELISPOTBAS-ELISA（生物素-亲和素系统）双抗体夹心法：用于检测特异性抗原。操作步骤：用已知抗体包板→洗涤→封板→洗涤→加入待检标本→洗涤→加酶标抗体→洗涤→加底物显色→结果观察间接法：用于检测特异性抗体。基本步骤：用已知抗原包板→洗涤→加入待检抗体→洗涤→加酶标二抗→洗涤→加底物显色→观察结果酶联免疫斑点实验A:用已知抗原检测分泌特异性抗原的B细胞：用已知抗原包被固相载体，B细胞分泌的抗体与之结合，加入酶标记的第二抗体，通过底物显色反应可检测B细胞分泌的特异性抗体。B:用抗细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子：用抗细胞因子抗体包被固相载体，加入不同来源的细胞，细胞分泌的细胞因子与包被抗体结合，再加入酶标记的抗细胞因子抗体，通过底物显色反应测定结合在固相载体上的细胞因子。BAS-ELISA生物素-亲和素系统借助所形成的亲和素-生物素-酶复合物追踪生物素标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应抗体或抗原。原理：生物素与亲和素的高度亲和力、生物素能与抗体结合（3）放射免疫测定法用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性。（4）化学发光免疫分析将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。（5）免疫印迹法又称Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原。