植物组织培养技术在农业中应用

第2章植物细胞工程主要内容：第一节植物组织培养概述第二节植物胚培养第三节植物茎尖培养与脱毒快繁第四节植物组织培养过程中常出现的问题第一节植物组织培养概述一、植物组织培养的一般概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。（狭义）组培指用植物组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株；指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。愈伤组织是指一种没有器官分化但能进行活跃分裂的细胞团。愈伤组织（Callus）二、组织培养的特点1、培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长,便于稳定地进行周年培养生产。2、生长周期短，繁殖率高由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。往往20-30d为一个周期。总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。三、植物组织培养类型1、胚胎培养指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。2、器官培养指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养。3、组织培养指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养。4、细胞培养指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。5、原生质体培养。指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养四、植物组织培养生产药物的优点1.周年生产，不受地区、季节及有害生物的影响。2.占地面积少，便于工厂化生产，可对细胞生长自动控制和代谢过程合理调节。3.便于筛选高产细胞株。4.利于生物转化，寻找新的有效药物成分。植物培养物作为一种生物反应器转化外源化合物，能够产生原植物所没有的，甚至是至今自然界尚未发现的化合物。5.个体差异小，生产周期短，设备简单，能节省人力、物力等。6.利用组织培养过程中出现的芽变或人工诱变，或进行脱毒，培育新品种，提高药用植物品质。7.保存种质资源。五、植物组织培养的应用1、快速繁殖稀有或有较大经济价值的植物名贵植物之所以名贵，是因为繁殖系数低。利用组织培养可以快速繁殖，如兰花等。经茎尖培养获得的脱毒苗一般数量有限，必须经过大量繁殖，在用于生产。2、植物脱毒特别是无性繁殖植物（如马铃薯、草莓、大蒜、康乃馨等）都带有病毒，严重影响植物的产量和品质。由于病毒是通过维管束传导的，因此利用这些植物营养器官繁殖，就会把病毒带到新的植物个体上而发生病害。感病植株并不是每个部位都带有病毒，如茎尖生长点尚未分化成维管束的部分，可能不带病毒。利用组织培养法进行茎尖培养，再生的植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒的苗，再用这种苗进行繁殖，则种植的植物就不会或极少发生病毒病。3、利用培养变异，选择优良突变体，培养新品种组织培养（包括器官培养、原生质培养等）突变率较高。选择较好的突变体，如早熟、矮秆性、抗旱性、抗寒性等。如日本培育的抗寒水稻，早熟草莓等都是利用培养变异。4、植物种质资源的保存、挽救珍稀植物保存植物种质的传统方法：用常温、低温、变温、低氧、充惰性气体等，储存果实、种子、块根、块茎、种球、鳞茎。存在问题：–代价高，占用间大，保存时间短，易受环境条件的限制。–植物组织培养结合超低温保存技术，保存一个细胞就相当与保存一粒种子，但所占的空间仅为原来的几万分之一在-193度的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。5、通过单倍体育种缩短育种年限通过花药和花粉组织培养可以获得单倍体植物，大大缩短了育种时间。使新品种的培育过程大大简化。6、胚胎培养的应用在远源杂交中，杂交后形成的胚珠往往在未成熟状态时，就停止生长，不能形成有生活力的种子，因而杂交不孕。用胚培养技术可获得杂种植物，这为在远缘时克服杂交不亲和的障碍提供了一项有用的技术。7、细胞融合–通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种货育成优良品种。8、用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工、生物工程等要揭开生命活动的秘密，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。9、利用组织培养的材料作为植物生物反应器中草药是宝贵的财富，但很多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产，不再依附于自然环境，不仅可以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系，来提高其药用价值。如用培养的人参悬浮细胞，来生产人参皂苷，已在日本等国家形成规模。利用培养的植物细胞和组织细胞作为生物反应器，也可以生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等，用生食蔬菜生产乙肝疫苗正在实验中。10、用于其它未知科学的研究植物组织培养也同样具有许多尚未发掘出的潜力，说不定有一天人们会在三角瓶内种出大南瓜。总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶段，远远没有达到它的高峰期，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力还远远没有发挥出来。相信在今后的几十年内，组织培养在我国将会有更大的发展，在农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大的经济效益。第二节植物胚培养在一般情况下，植物的胚胎是从精卵结合形成合子开始的，合子经过分裂形成胚柄和胚体，胚体进一步分裂，并且分化，逐渐形成具有一定形态结构的胚。当种子发芽时，胚长成植株。胚胎培养是指采用人工方法把胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌条件下，让其进一步生长发育，一直形成幼苗的过程。单子叶植物胚双子叶植物胚一、胚胎培养的意义离体胚胎培养可以克服种、属间受精障碍；打破种子休眠，缩短育种周期；克服种子生活力低下和自然不育等。二、培养类型胚胎培养的对象包括胚胎发生过程中不同发育时期的胚和具胚结构。胚的发育对营养的要求有两个阶段：1.异养期处于这一时期的幼小胚完全依赖和吸收周围组织的有机营养物质。2.自养期在此时期胚能吸收培养基中的无机盐和糖，经过自身的代谢作用合成其生长必需的物质。离体胚的培养分为两种类型：即成熟胚培养和幼胚培养（指子叶形成之前）。三、成熟胚的培养1.成熟胚培养的概念成熟胚培养：是指子叶已形成的种胚。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育。2．培养方法：将受精（传粉）后的果实或种子（带表皮），经表面灭菌后，在无菌操作台，剥出种胚接种于预先配制好的培养基上，使裸露的胚在人工控制的条件下，发育成一棵完整的植物体。3．玉米成熟胚培养过程1）外植体消毒取玉米种子放在盛有95％的酒精中消毒10s，检查果皮是否完整，若有水进入果皮中而呈透明斑块的种粒，应丢弃。保留那些果皮完整、外貌无改变的种子。在无菌条件下，将种子放入75％乙醇中消毒15s，用0.1%升汞浸泡10～20分钟，用无菌水冲洗3次。2）外植体预培养把种子放置到有1张湿润的无菌滤纸的培养皿，于25℃的黑暗条件下培育6h，种子将吸水膨胀，变软。3）剥胚种子吸涨后，将胚剥离出来。取一粒种子放在无菌培养皿中，用镊子固定，用另一把镊子轻轻剥去种皮。解剖刀沿着胚胎的边缘小心切除胚乳，暴露出位于其下方的种胚的一部分－盾片。分离出胚胎后，用无菌水将每一个胚胎冲洗3次，然后移入装有培养基的三角瓶。培养基为MS培养基＋0.5mg/l细胞分离素。4）培养25℃的黑暗环境中培养5）外植体表现：大约在培养2天后出现胚根，3－4天后出现胚芽，7～9天后出生根迅速生长并出现一些不定根，10天后可以长成小苗。四、幼胚培养幼胚培养：一般植物开花后12～20天时期：胚龄处于原胚期、球形胚、心型期、早鱼雷期的培养。要求的条件：这几个时期幼胚从生理至形态均未成熟，提供一定温度和湿度均不能发芽，必须提供碳水化合物氮源以及植物激素等营养物质。(一)幼胚培养的意义1、克服远缘杂交不亲和性在育种工作中，采用远缘杂交的方法将野生种优质基因导入栽培种。但远缘杂交经常得不到有活力的种子，其原因是许多情况下由于受精胚发育不良、或没有胚乳，或不能正常发育等，从而造成幼胚早期败育。如果在幼胚败育之前取出杂种胚进行培养，就可以再生出杂种植株，克服上述困难。2、用于快速繁殖幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生产生大量的再生植株。3、获得胚性细胞或胚性愈伤组织为原生质体培养、细胞融合及基因转化提供试验材料。胚性愈伤组织再生能力较强，利用幼胚培养，诱导胚性愈伤组织，分离原生质体进行培养，或进行细胞融合，以及基因转化，能提高其再生频率。4、利用培养变异，选育新品种（二）幼胚培养的方法应用于胚拯救的幼胚培养步骤：1）杂交2）取材3）消毒4）剥取幼胚及接种5）培养6）驯化移栽与染色体加倍1、杂交根据育种目标，选择亲本，人工授粉（包括：母本去雄、套袋、授粉）。2、取材在远缘杂种胚败育前，将幼胚由母体上取下，进行培养。各种植物远缘杂交，幼胚败育时间不同3、消毒分别用75％乙醇和0.1％升汞消毒。4、剥取幼胚及接种在超净工作台内，用解剖针或解剖刀从液体状的胚乳中挑取幼胚，随即接种于培养基上。幼胚太小时，可在解剖镜下操作。5、培养如果杂种胚败育较晚，胚发育较大，培养时，往往不进入脱分化，而直接发育长成幼苗。此种情况下，培养基中不加激素也能长成植株。如果杂种胚败育较早，胚发育较小，培养时，培养基中需要添加激素。根据植物不同和再生途径不同，添加激素种类和浓度不同。如果通过胚状体发生再生植株，可添加2，4-D；如果通过不定芽再分化，可添加生长素和分裂素。6、驯化移栽与染色体加倍驯化方法与前述相同。染色体加倍，如白菜2n=20，甘蓝2n=18，二者杂交杂种为19，不能进行正常减数分裂，所以必须加倍处理。处理方法后述。7、应用利用胚培养克服远缘杂交不亲和性已在许多植物上成功，如西红柿、茄子、辣椒、油菜、南瓜、大豆、花生、水稻、小麦、大麦、大葱、萝卜等与其近缘野生种，白菜×甘蓝，以及百合花等花卉。(三)影响幼胚培养的因素1.胚龄2.培养基成分3.培养条件4.胚柄等胚附属物荠菜胚胎不同发育时期对营养的需求胚发育时期胚长(μm)营养要求球形胚早期22-60小于40μm的胚对营养的需求不详球形胚晚期61-80基本培养基(大量元素①+微量元素②+维生素③+2%蔗糖)+IAA(0.1mg/L)+KT(0.001mg/L)+硫胺腺嘌呤(0.001mg/L)心形胚期81-450仅基本培养基鱼雷形胚期451-700大量元素①+维生素③+2%蔗糖拐杖形胚及成熟期700及更大大量元素①+2%蔗糖（三）非远缘杂交幼胚培养用于快速繁殖、诱导胚性愈伤组织及利用培养变异，选育新品种等。1、取材一般在开花授粉后12-15天取幼胚。过早，幼胚太小，不容易取；过晚，幼胚发育太大，不进入脱分化，不能形成愈伤组织或胚状体，而直接长成幼苗。取材时间也因植物不同，稍有区别。2、消毒、剥取幼胚及接种与上相同3、培养幼胚培养，一般通过诱导胚性愈伤组织或胚状体再生植株，因为幼胚培养比较容易形成胚性愈伤组织和胚状体。培养基可以用M