壳聚糖基分子印迹磁性微凝胶的制备及释药特性

壳聚糖基分子印迹磁性微凝胶的制备及释药特性唐春燕王红飞张黎明中山大学化学与化学工程学院广州510275摘要：分子印迹凝胶(MIHs)在分离、催化、传感等领域有重要应用，近年倍受关注。本研究以羧甲基壳聚糖为功能聚合物母体，京尼平为交联剂，经硅氧烷改性的Fe3O4粒子为磁性组分，采用油包水（W/O）反相乳液法制备新型咖啡因印迹磁性微凝胶（Fe3O4@SiO2@MIHs）和非分子印迹磁性微凝胶（Fe3O4@SiO2@non-MIH）。用红外IR、XRD、SEM、荧光光谱和磁学性能测量系统对微凝胶的组成、结构和性能进行了表征。释放实验表明，咖啡因在印迹微凝胶中的释放速率要比在非印迹微凝胶中的慢，且释放速率受模板分子和咖啡因负载量的影响。茶碱在咖啡因印迹微凝胶中的释放实验表明微凝胶对咖啡因有特异选择吸附性。关键词:分子印迹微凝胶壳聚糖;京尼平;药物释放前言分子印迹技术（molecularimprintingtechnique,MIT）是制备在空间结构和结合位点上与模板分子相匹配的材料，即分子印迹材料(molecularlyimprintedmaterials,MIMs)的技术，常被形象的描述为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”技术。分子印迹材料由于制备简单、功能可设计、坚固耐用而被誉为“万能的分子识别材料”，在传感、模拟酶、催化、离等领域得到了广泛的应用。[1-2]传统方法制得的MIHs多为块状，需经粉碎、过筛等工序，获得的材料形状不规则、粒径分布宽，且粉碎过程中会破坏部分识别位点，产率较低。[3]因此，制备结构规整、小尺寸，并具有更高的亲和力、选择性的MIHs是未来发展的趋势。近年来，具有超顺磁性的材料在生物医学和生物科技方面收到人们的广泛关注，包括靶向药物输送、核磁共振成像（MRI）对比增强、生物传感器、快速环境和生物分离、痕量特定目标物质的浓缩。[4]赋予分子印迹材料磁性能，将有助于扩大其应用范围。MIHs的传统应用领域是基于他们的选择吸附特性，但对MIHs的解吸附性能的研究则是一个相对较新的领域。一些早期的研究表明这些具有亲和性的材料可能在药物控制输送中具有潜在的应用价值。[5]将MIHs应用于药物输送上可能实现药物智能释放或者药物靶向输送。多糖类天然高分子材料在药物输送领域得到了广泛的应用，因此，使用多糖为原料制备分子印迹材料引起人们极大的兴趣。壳聚糖是通过碱化处理几丁质而部分去乙酰基的聚多糖，而几丁质是自然界中最丰富的生物材料之一，它在生物医学上的应用已经得到了广泛的研究。京尼平作为一种新的天然交联剂，可以从栀子的果实中分离得到。与戊二醛相比，京尼平的细胞毒性要小10000倍。[6]本研究将分子印迹技术与磁性、药物释放相结合，用油包水反相乳液法制备了分子印迹磁性微凝胶。实验部分1.实验材料壳聚糖（Mr=190000-310000，85-90%的脱乙酰度）Aldrich，京尼平WakoPureChemicalIndustriesLtd，KH-550江汉化学厂有限公司，吐温、司班、茶碱、咖啡因均由AlfaAesar提供，其他未列出的试剂均为分析纯，由广州光华化学厂有限公司提供。2.Fe3O4纳米粒子的制备将1.99gFeCl2·4H2O、5.41gFeCl3·6H2O分别溶于20mL水中，然后在强烈的机械搅拌下把两种铁盐溶液混合均匀。在室温下将200mL0.6M的NH4OH溶液加入到混合溶液中去，然后加入30mL浓缩的氨水（25w/w%）以保持反应的pH值在11到12之间。生成的棕褐色物质继续在室温下搅拌1h后升温回流1h，整个制备过程都是在氮气的保护下进行的。生成的Fe3O4纳米粒子用永久磁铁分离，倾去上层液，然后用水和乙醇洗涤所得的粒子，最后把它重新分散在50mL纯水中。3.Fe3O4@SiO2-NH2粒子的制备将2mL氨水(25%)、10mL水、3mL先前制备的磁性纳米粒子溶液、10mL乙醇溶液混合均匀，在机械搅拌的情况下向混合溶液中加入KH-550的乙醇溶液（1mLKH-550溶于15mL乙醇中），室温下持续反应6h。生成的粒子用磁铁分离，水洗去过量的反应物，然后重新分散在25mL纯水中。4.羧甲基壳聚糖CMCS的制备在室温下，将5.0g壳聚糖加入到50mL的异丙醇中，搅拌30min后加入12.5mL的氢氧化钠溶液。然后向混合溶液（其中氢氧化钠的浓度为13.3M）中逐滴加入含25g氯乙酸的异丙醇溶液，然后升温到60◦C继续反应4h。产物用乙醇沉淀后洗涤至中性，真空干燥。5.Fe3O4@SiO2@MIH磁性微凝胶的制备将一定量的Fe3O4@SiO2-NH2粒子和咖啡因加入到2%的CMCS水溶液中进行充分的相互作用，然后在搅拌下将混合溶液加入到正己烷（含有2%的Span80和1%的Tween20）中乳化半小时。将一定量的京尼平甲醇溶液（100mg/mL）逐滴加入到混合液中，室温下反应24h。反应结束后用永性磁铁分离产物，并用乙醇和水反复洗涤以去除表面活性剂和未包裹Fe3O4@SiO2的MIHs。在相同的实验条件下，不加模板分子咖啡因制得非印迹的微凝胶Fe3O4@SiO2@non-MIH。将制得的MIH及non-MIH用乙酸/甲醇溶液（体积比为1/9）浸泡24h洗脱，之后用甲醇洗，最后用去离子水洗至在溶液中检测不到咖啡因。过滤后在40oC下真空干燥。6.咖啡因的释放实验研究咖啡因在不同条件下制备的分子印迹微凝胶中的释放特性，改变的实验条件包括模板分子的用量和咖啡因的负载量等。具体的实验过程如下：将0.1g干燥的印迹微凝胶或非印迹微凝胶分别浸泡在一定浓度的咖啡因水溶液中2d，然后经分离、干燥得到负载咖啡因的微凝胶。将负载咖啡因的微凝胶置于50mLpH=7.4的磷酸缓冲溶液中，并于30oC及缓慢搅动条件下，每隔一定时间采用紫外-可见分光光度法测定释放量。咖啡因的测量波长为261.0nm，咖啡因的最初负载量可以视为与实验结束时咖啡因的总释放量相等。不同时间的咖啡因释放百分比可以通过下式计算：Percentrelease（%）=（Mt/M∞）×100(1)其中Mt是在t时刻咖啡因的累积释放量，M∞是在无限长的时间后咖啡因的累积释放量。7.茶碱的释放实验为了表征制得的微凝胶对分子具有特异选择性，我们选择了分子结构几乎和咖啡因一样的茶碱做对照实验。咖啡因和茶碱的结构式见图1。将0.1g干的Fe3O4@SiO2@MIH和Fe3O4@SiO2@non-MIH分别浸泡在一定浓度的茶碱水溶液中2d。然后经分离、干燥得到负载茶碱的微凝胶。将负载茶碱的微凝胶置于50mLpH=7.4的磷酸缓冲溶液中，并于30oC及缓慢搅动条件下，每隔一定时间采用紫外-可见分光光度法测定释放量。茶碱的测量波长为272.0nm，茶碱的最初负载量可以视为与实验结束时茶碱的总释放量相等。不同时间茶碱的释放百分比可以通过下式计算：Percentrelease（%）=（Mt/M∞）×100(1)其中Mt是在t时刻时茶碱的累积释放量，M∞是在无限长的时间后茶碱的累积释放量。NNNNOCH3H3COCH3NNNHNOCH3H3COCaffeineTheophylline图1咖啡因和茶碱的结构结果和讨论1.红外光谱分析30002000100012203740dcbaWavenumbers(cm-1)34405861116111411151725137412091630143516031401图2红外光谱图图2中a、b、c、d分别为Fe3O4，Fe3O4@SiO2，Fe3O4@SiO2@MIH在模板分子洗脱前和洗脱后的红外光谱图。图a中586.0cm-1是氧化物的吸收峰，本实验中是Fe3O4特征峰。b、c、d分别在1116cm-1、1114cm-1、1115cm-1处存在着Si-O-Si的伸缩振动峰吸收峰，但a在1115cm-1附近并没有相应的吸收峰。这证明了Fe3O4改性的成功。c在1209，1374，1725cm-1处存在着吸收峰，但是在d却没有相应的吸收峰，表明了d中的模板分子咖啡因已被完全洗脱。另外，d中Fe3O4@SiO2@MIH中羧甲基壳聚糖中羧基的特征吸收峰1603和1401cm-1，在c中已经分别移到了1630和1435cm-1处。这是由于在未洗脱模板分子的印迹微凝胶中咖啡因通过弱的非共价作用（例如静电相互作用、范德华力和氢键）而与功能基团羧基间存在着一定的相互作用，即存在识别位点而使吸收峰偏移。2.荧光分析35040045050055060005101520edcbaIntensityWavelength(nm)aMIHs(extraction)bMIHs(rebinding)cMIHs(extractedagain)dUMIHseUMIHs(binding)图3荧光发射光谱图3分别展示了在激发波长为360nm、不同条件下微凝胶的荧光发射光谱。a、b、c分别是印迹微凝胶在模板分子洗脱后、洗脱后再次吸附、第二次洗脱的荧光光谱。d、e则分别是非印迹的微凝胶在模板分子加入前后的荧光光谱。a、c和d是在纯水中测定的，而b和e则是在0.5mg/mL的咖啡因水溶液中测定的，并且事先平衡24h。从图中可以看出，最大发射波长在465nm左右。对印迹微凝胶Fe3O4@SiO2@MIH而言，模板分子被第一次洗脱后的荧光强度最大（曲线a），重新吸附模板分子后出现了荧光猝灭现象（曲线b），但是第二次洗脱模板分子后（曲线c），荧光强度较吸附后有所增强，但仍比第一次模板分子洗脱后的荧光强度要弱。但是对非印迹微凝胶Fe3O4@SiO2@non-MIH而言，模板分子咖啡因的加入对其荧光强度几乎没有影响。分析以上现象可以得出荧光的淬灭是由于所加入的模板分子与微凝胶上的功能基团相互作用、相互识别的结果，由此也证明了聚合物中识别位点的存在。3.X射线衍射分析20304050607080abc2θ220311400422511440图4X射线粉末衍射图图4中a、b、c分别为Fe3O4，改性Fe3O4和印迹微凝胶Fe3O4@SiO2@MIH的X射线衍射图。a、b、c在2θ=30.1,35.5,43.1,53.4,57.0,和62.6，都显示了比较强的峰，这些信息和标准数据库JCPDSfile(PDFNo.85-1436)中的信息相符。这六个可辨别的特征峰分别对应着（220）,（311）,（400）,（422）,（511）和（440）晶面，制得的Fe3O4为尖晶石结构。而且，由此也证明了在Fe3O4上包裹硅层和交联的壳聚糖后，并未导致Fe3O4发生相变。4.磁性能分析-10000-50000500010000-60-40-200204060baMagnetization(emu/g)Magneticfield(Oe)图5Fe3O4@SiO2（a）和Fe3O4@SiO2@MIH（b）在300K条件下的磁滞回线图6磁场作用下MIH的分离效果图对于磁性材料来说，磁响应是磁性材料的一项至关重要的性能。[7]磁滞回线表征了磁性材料对外加磁场的响应能力。图5分别为Fe3O4@SiO2（a）和Fe3O4@SiO2@MIH（b）的磁滞回线。从图5可以看出两者的形状很相似，都呈S形。当外加磁场强度减小至零时，剩余磁化强度Mr为零，矫顽力也为零。这说明制备出的微凝胶具有超顺磁性，保持磁化强度的能力很小，有利于外磁场撤去后的重新分散。Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@MIH的饱和磁化强度Ms分别为59.6emu/g和32.0emu/g。虽然Fe3O4@SiO2@MIH的饱和磁化强度与Fe3O4@SiO2相比有所下降，但是它对外加磁场仍有十分好的磁响应性，在其完成对模板分子的主动吸附与识别后便可在外加磁场作用下很容易地将其固、液相分离。图6为在外加磁场作用下Fe3O4@SiO2@MIH的分离、重新分散效果图。当外加磁场不存在时，瓶子中黑色均一液能够稳定的存在。但当在瓶子右边放置一块永久磁铁时，原来的黑色粒子就被吸引到有磁铁的一边，溶液就变得澄清透明了。由于Fe3O4@SiO2@MIH具有超顺磁性，因此制得的微凝