大环内酯类药物抗菌作用分子机制及其支原体耐药性研究进展

大环内酯类药物抗菌作用分子机制及其支原体耐药性研究进展吴聪明中国农业大学动物医学院大环内酯（Macrolides）类药物是由链霉菌产生或半合成的一类以一个大环内酯为母体，通过羟基，以苷键和1～3个糖分子相连而成的弱碱性抗生素。按其内酯环上碳原子数的不同，分为十四、十五和十六元环内酯类抗生素。自1952年Lilly公司将红霉素成功开发上市以来，迄今已开发出大环内酯药物逾百种，用于临床的已有十几种。大环内酯类抗生素除对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性外，对耐青霉素金黄色葡萄球菌、部分革兰氏阴性菌、部分厌氧菌、支原体、衣原体、军团菌、胎儿弯曲杆菌、螺旋体和立克次氏体等均有抗菌活性，比氨基甙类、四环素类和多肽类等抗生素的毒副作用和不良反应低，无青霉素类抗生素的严重过敏反应，因此在临床上获得广泛应用。为了克服红霉素等第一代大环内酯类抗生素对酸不稳定、易产生耐药性、胃肠道刺激强等弱点，各个国家竞相对大环内酯类药物原有结构进行改造，获得了一系列抗菌活性更强、药动学参数更优的第二代大环内酯类药物（包括罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、克拉霉素、阿齐霉素等）。第二代大环内酯类抗生素具有：1）对酸稳定，口服生物利用度高；2）血浆药物浓度、组织体液及细胞内药物浓度高；3）血浆半衰期延长；4）胃肠道反应轻等特点。但其抗菌谱、临床适应证与第一代大环内酯类抗生素相似，仍易诱导耐药性。因此以扩展抗菌谱，增强抗菌活性，克服诱导耐药性为方向，开始了第三代大环内酯类药物的研究，至今已开发出了酮内酯（Ketolides）、酰内酯（Acylides）、氮内酯（Azzilides）等大环内酯药物新亚类，其中酮内酯类的泰利霉素（telithromycin）已被批准用于临床，有效控制了多重耐药肺炎链球菌等感染（1-4）。新型大环内酯类药物研发方兴未艾，但随着大环内酯类药物在人医及兽医临床上的广泛应用，肺炎链球菌、支原体等病原菌对其耐药性逐渐上升，严重影响了该类药物的疗效（5-8）。阐明药物的抗菌作用机制及耐药机制，是指导临床合理用药，设计开发更好药物的先决条件。本文对大环内酯类药物的抗菌作用机制尤其是分子机制文献进行了综述，并跟踪了支原体对大环内酯类药物耐药性的研究进展。大环内酯类药物抗菌作用分子机制一、大环内酯药物的结合靶位十四元大环内酯类红霉素（Erythromycin）、克拉霉素（Clarithromycin）、地红霉素（Dirithromycin）、罗红霉素（roxithromycin）、十五元大环内酯类阿奇霉素（Azithromycin）以及十六元大环内酯类螺旋霉素（Spiramycin）、交沙霉素（Josamycin）、泰乐菌素（Tylosin）和麦迪霉素（Midecamycin）等在结构上与红霉素相似，与细菌的靶结合位点也与红霉素基本相同。一些不属于大环内酯类的抗生素，如林可胺类（Lincosamide）和链阳性霉素B（StreptograminB）虽然与大环内酯类的分子结构不同，但因为它们与大环内酯类药物同细菌rRNA的结合位点存在较大的重叠，故称为MLSB药物。大环内酯类药物对细菌的作用靶位是核糖体，细菌核糖体由30S小亚基和50S大亚基组成，大亚基又由23SrRNA和核糖体蛋白组成，23SrRNA分Ⅰ～Ⅵ个域，根据碱基互补配对原则折叠成二级结构，并与核糖体蛋白作用维持其立体构象（见图一）。早前利用生化和遗传学技术绘制了大环内酯类药物在细菌核糖体大亚基上的结合作用部位（9-14）。但有关各种大环内酯类药物与核糖体相互作用的详细分子机制，却在成功获得几种细菌核糖体大亚基及其与抗生素复合体的晶体结构以后，才开始得以阐明（15-18）。核糖体及其抗生素复合体晶体衍射证实了RNA是构成大环内酯类药物结合靶位的主要成分（见图四）。即23SrRNAⅤ域内的许多核苷残基与大环内酯类药物分子相互作用，尤其是，十四、十五、十六元内酯环上C5位的单糖或二糖侧链与rRNA之间形成了强烈相互作用。红霉素和其它十四元环药物的脱氧氨基糖（desosamine，德糖胺）侧链与23SrRNAⅤ域A2058和A2059（按E.coli核苷酸序列编号）分子上的氮原子形成氢键。23SrRNAⅤ域2611-2057位的碱基尤其是2057位的核苷，也可能与十四元内酯环C5位的脱氧氨基糖形成氢键（18），还可直接与内酯环产生疏水作用（16）。此外，脱氧氨基糖侧链还能与G2505的磷酸骨架发生相互作用，十六元内酯环C5位的碳霉胺糖-碳霉糖（mycaminose-mycarose）侧链也能与2058位的腺苷形成氢键，表明该位置核苷是所有大环内酯药物的主要结合部位之一。泰乐菌素、碳霉素A（carbomycinA）和螺旋霉素C5位的碳霉胺糖-碳霉糖还可能与23SrRNAⅤ域的其它区域产生疏水作用。内酯环C5位的糖基与2057-2059之间的相互作用可解释为什么该部位的核苷突变或2058位腺苷二甲基化可造成大环内酯类药物耐药性（18）。内酯环与核糖体之间的相互作用可占药物自由结合能的25%（19）。其中内酯环与23SrRNAⅤ域2057-2059位碱基形成的疏水作用尤为突出（19）。Haloarculamarismortui的核糖体大亚基与十六元环泰乐菌素、碳霉素A和螺旋霉素形成的复合体结晶结构衍射（16）结果表明，内酯环C6位的乙醛基与23SrRNAⅤ域A2062的N6形成了一个可逆性的共价键，从而增强了这些药物的结合能。这种相互作用在十四元环红霉素和十五元环阿齐霉素不存在，因为它们内酯环的C6位是一个羟基或酯基，该结合作用可解释为什么细菌23SrRNAⅤ域2062突变可造成十六元环耐药而对十四、十五元环敏感性无影响。酮内酯是最近开发出的新三代大环内酯类药物。它们以内酯环C3位的克拉定糖被酮基取代为特征，多数酮内酯药物还含有烷芳基侧链及一个11，12-氨基甲酸。与结构改造前的大环内酯类药物相比，酮内酯药物与核糖体之间具有更强的结合力（20，21）。最近解析了酮内酯药物——ABT-773与D.radiodurans核糖体复合体的结晶，结果未能获得酮内酯亲和力提高的分子线索。红霉素及其它十四元环药物的内酯环上11，12位的羟基能与23SrRNA的U2609形成氢键。在ABT-773（及其它酮内酯药物）结构上由氨基甲酸取代了羟基，在D.radiodurans50S亚单位中也与能与U2609形成氢键。生化证据表明这种相互作用对酮内酯比对红霉素及其它十四元环药物更重要，因为U2609→C可造成细菌对酮内酯耐药而对其它药物无影响（19）。但是，这种突变的重要意义未能在晶体结构上获得证据。生化和遗传学证据表明各种大环内酯类药物包括红霉素、酮内酯和泰乐菌素与23SrRNAⅡ域内的35螺旋（helix35）还存在相互作用（10，14）。细菌23SrRNA的35螺旋发生突变或转录后修饰可引起大环内酯低水平耐药（14，22）。晶体结构显示十六元环泰乐菌素的粘多糖（mucinose）侧链完全可到达35螺旋并与之结合（19），但却没有发现十四元环红霉素、ABT-773和阿齐霉素与35螺旋的相互作用（18）。目前，除酮内酯11，12-氨基甲酸与23SrRNA的U2609存在相互作用外，在晶体衍射研究中还未发现酮内酯侧链与核糖体之间存在其它相互作用，因此，酮内酯11，12-氨基甲酸与U2609之间的相互作用可能是该类药物与23SrRNA结合力进一步增强的主要因素。大环内酯药物分子通过其功能基团与核糖体的23SrRNA之间形成的疏水作用和氢键作用（一些十六元环药物还存在共价键作用）限制在作用靶位，这些与rRNA的相互作用占据了药物分子大部分的结合自由能。此外，一些大环内酯类药物还能与核蛋白的L4和/或L22域相互作用。如泰乐菌素的粘多糖侧链与L22相互作用，螺旋霉素的糖胺（furosamine）残基与L4相互作用（19）。核蛋白与大环内酯分子之间的相互作用可解释为什么核蛋白L22和L4域的编码基因突变可引起大环内酯类药物耐药（23-26）。二、大环内酯类药物抗菌作用的分子机制大环内酯类药物对蛋白质合成抑制的详细分子机制取决于药物特定的化学结构。因为药物分子结构影响其与核糖体的相互作用及抑制作用方式。大环内酯类药物对蛋白质合成抑制可归纳为四种方式：1）在翻译早期抑制新生肽链的延伸（27，28）；2）促使肽基转移RNA从核糖体上的解离脱落（29）；3）抑制多肽键的形成（27）；4）干扰50S亚单位的组装（26）。以上大环内酯类药物的作用方式与它们在细菌核糖体上的结合靶位有关。大环内酯类药物的结合靶位在核糖体大亚基内新生肽出口通道的肽基转移酶中心附近。药物分子内酯环C5位的糖基伸至肽基转移酶中心，十六元环泰乐菌素、螺旋霉素和碳霉素A（carbomycinA）C5位的碳霉胺糖-碳霉糖侧链较长，可伸至肽基转移酶的活性部分直接干扰肽键形成的催化过程（16，30）。十四元环红霉素等药物分子由于C5位的脱氧氨基糖残基较短，达不到肽基转移酶位置，从而使得它们缺乏转肽作用的抑制效应（31-33）。大环内酯类药物对蛋白合成抑制的主要机制与它们结合在新生肽出口通道有关。出口通道主要由23SrRNA构成，通道始于肽基转移酶中心，跨越整个亚单位后开口于另一侧表面（见图二、图三）（15，34-36）。早期认为核糖体内新生肽的合成过程中这个通道是惰性的、不活动的，事实上整个通道是一个极其活跃的功能单元（37）。研究表明，核糖体与通道内的新生肽相互作用，影响蛋白合成的延伸过程及核糖体肽基转移酶的催化反应（28，38，39）。通道相对较宽（平均约15埃），但距离肽基转移酶中心不远却有一个由糖蛋白L4和L22域形成的狭窄部（宽约10埃）。大环内酯类药物紧紧接合于这个狭窄部，对正在生长延伸的多肽链起着分子路障（molecularroadblock）作用（16，18，37）。刚开始几个氨基酸可自如形成新生肽，但当新生肽延生长伸达到通道的狭窄部时，如果有药物结合于该位置，则阻抑多肽的顺畅通过迫使多须的延伸过程停止下来。一旦多肽合成受到抑制，肽基转移RNA也就会从核糖体上解离脱落下来。至今仍未能确定结合有大环内酯药物的核糖体所能催化新生肽生长的长度。在聚腺苷依赖（poly(A)-dependent）无细胞翻译系统中，大环内酯可引起二-赖氨酸的积聚，但抑制了更长肽链的合成；在聚尿苷依赖（poly(U)-dependent）蛋白合成系统中，红霉素引起了二-苯丙氨酸、三-苯丙氨酸的积聚，而抑制了更长肽链的生成（32，33）。最近从人工合成mRNA驱动的体外翻译系统中观察到红霉素可引起携带6-8个氨基酸肽链的肽基转移RNA积聚，这种现象似乎与以上述红霉素对短肽延伸抑制情况相矛盾。此外，酮内酯类药物替利霉素（telithromycin）可使核糖体合成9-12氨基酸的新生肽。模型研究表明肽基转移酶中心至大环内酯结合狭窄部的间距仅仅适合容纳6-8个氨基酸（18）。因此，红霉素为什么会影响二肽的延伸？替利霉素为什么又会让12氨基酸的新生肽合成？是否新生肽以特定方式在核糖体内折叠？是否在大环内酯类药物抑制作用下新生肽生长长度取决于肽内氨基酸的构成及序列？目前仍不得而知。可能长肽链在生长过程中比短肽链更易受到抑制。此外，由于大环内酯类药物分子和新生肽竞争同一出口通道，如果特定肽链同大环内酯类药物分子一样与出口通道壁之间存在亲和力，则有可能通过竞争将药物分子从结合部位挤出，如果是这样，不同蛋白合成受大环内酯类药物分子抑制的程度就会存在差异，差异性取决于药物结构、新生肽结构、药物分子和新生肽与核糖体之间的相互作用。大环内酯类药物干扰核糖体组装可能进一步增强了它们对蛋白合成的抑制作用（40，41）。50S大亚基是由23SrRNA、5SrRNA和20多种蛋白组装而成的,组装过程中先后有32S、42S中间产物产生。当细菌生长环境中存在大环内酯药物分子时，中间产物可能会和药物分子结合上，从而影响了特定分子构象重排，阻止了具完整功能50S大亚基的组装，无功能的50S大亚基中间产物因不能进一步形成有功能的核