天然药物化学实验

天然药物化学实验目录实验须知实验一薄层板的制备、活度测定及应用实验二粉防已生物碱的提取、分离与鉴定实验三掌叶防已碱的提取及硫酸延胡索乙素的制备实验四湖北贝母总生物碱的提取与初步鉴定实验五秦皮中七叶苷、七叶内酯的提取、分离和鉴定实验六虎杖中游离羟基蒽醌成分的提取和分离实验七芦丁的提取、分离与鉴定实验八穿心莲内酯的提取、分离、鉴定及亚硫酸氢钠加成物的制备实验九薯蓣皂苷元的提取和鉴别实验十中草药成分鉴别法附录一常用试剂及配制方法附录二常用有机溶媒的性质及回收方法实验须知天然药物化学实验教学是天然药物化学课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握中草药有效成分提取、分离和鉴定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力，养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。一、天然药物化学实验须知1.遵守实验室制度，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生，若发生事故应立即报告指导教师。2．实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，安排好当天计划，争取准时结束。实验过程应养成及时记录的习惯，凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录。实验完毕后，认真总结，写好报告，将提取纯化所得单体产物包好，贴上标签（日期、样品名称、纯度、mp、bp、TLC、重量）交给老师。3．实验中应保持安静，不许大声喧嚷，不许抽烟，不迟到、不随便离开。实验台面应保持清洁，使用过的仪器及时清洗干净，存放在实验柜内。废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。4．使用仪器时要轻拿、轻放，贵重仪器未经教师允许不得擅自动用。一旦损坏仪器应及时报损、补领，不得乱拿，乱用别人的仪器。公用仪器及药品用完后立即返还原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。节约用水、用电、药用试剂，严格药品用量。5．保持实验室内整洁，学生采取轮流值日。每次实验完毕，负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物缸，检查水、电和门窗是否关闭。二、实验报告格式天然药物化学实验报告的格式不是固定不变的，可以按题目的内容及要求作适当调整。一般包括下列内容：1.题目2．目的要求3．基本原理主要的提取分离及鉴定原理。4．步骤简明扼要概括实验步骤，包括现象记录。5．实验结果包括化学反应的试剂、现象及结论，色谱鉴定条件，产品颜色、晶形、重量、熔点以及得率等。6．讨论包括实验过程中主要注意事项、关键步骤、实验成败的原因及心得体会。7．思考题可以根据老师的要求，回答各实验中的某些思考题。实验报告要求字迹端正，图表清楚．叙述有条理，尽量做到既有观察的实验现象又有说明和解释；既有实验数据又有分析和结论；既有成败的经验教训又有自己的实践体会，甚至有改进的建议。实验一薄层板的制备、活度测定及应用一、实验要求1.掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法2．掌握吸附剂活度测定的原理及方法3．应用薄层层析法检测中草药化学成分二、实验原理当一个混合物被倒入固定相中，并用另一个流动相洗脱时，由于混合物中各组份与固定相和流动相的相互之间的作用不同，致使各组份通过固定相的速率不同，从而使混合物中各组份得到分离。三、实验仪器与试剂仪器：烘箱，玻璃板，研钵，水浴锅，天平，薄层涂布器试剂：氧化铝，纤维素，聚酰胺,硅胶,羧甲基纤维钠，甲酸，0.01%二甲基黄、苏丹红，靛酚蓝，苯，偶氮苯，对甲氧基偶氮苯，苏丹黄，苏丹红，对氨基偶氮苯，四氯化碳四、实验步骤（一）薄层板的制备1.加粘合剂的薄层涂布法（1）氧化铝薄层将吸附剂置于薄层涂布器中，调节涂布器的高度，向前推动，即得均匀薄层。本实验主要用下述简易操作涂布薄层，取表面光滑、直径统一的玻璃一支，依据所制备薄层的宽度、厚度要求，在玻璃棒两端套上厚度为0.3~1mm的塑料圈或金属环，并在玻璃棒一端一定距离处套上较厚的塑料圈或金属环，以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将氧化铝粉均均地铺在玻璃板上，匀速向前推动。（2）纤维素薄层一般取纤维素粉1份加水约5份，在烧杯中混合均匀后，倒在玻璃板上，轻轻振动，使涂布均匀，水平放置，待水分蒸发至近干，于100±2℃干燥30~60分钟即得。（3）聚酰胺薄层取锦纶丝（无色干净废丝即可）用乙醇加热浸泡2~3次，除去腊质等。称取洗净的锦纶丝1克，加85%甲酸10ml，在水浴上加热使溶，再加70%乙醇6ml。继续加热使完全溶解成透明胶状溶液。将此溶液适量倒在水平放置的，用清洁液洗净的玻璃片上，并自然向周围推匀，厚度约0.3mm，薄层太厚时，干后会裂开。将铺好的薄层水平放在盛温水的盘上，使盘中的水蒸汽能熏湿薄层，盘子加玻璃板盖严密，薄板放置约1小时完全固化变不透明白色，再放数小时后，泡在流水中洗去甲酸，先在空气中晾干，后在烘箱中0℃恒温加热活化15分钟，冷后置干燥器中贮存备用。2．加粘合剂薄层的涂布法（1）硅胶G薄层取硅胶G或硅胶GF一份，置烧杯中加水约5份混合均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布），均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中100℃活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只需在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。（2）硅胶（H）羧甲基纤维钠（CMC-Na）薄层取羧甲基纤维素0.2g，溶于25ml水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，倒入烧杯中，加薄层层析用硅胶（颗粒度10~40μm的约6~8g）混成均匀的稀糊，按照硅胶G薄层涂布法制备薄层，或取0.8%羧甲基纤维纳10ml，倒入广口瓶（高约10~12cm）中，然后逐步加入薄层层析用硅胶3.3克，不断振摇成均匀的稀糊，把两块载玻片面对面结合在一起，这样每片只有一面与硅胶糊接触，使薄片浸入硅胶稀糊中，然后慢慢取出，分开二块薄片，将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上，让其自然阴干，100℃下烘30分钟。冷后于干燥器内备用。未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内，以供再用。氧化铝薄层、氧化铝羧甲基纤维钠薄层的制备方法同上，一般所需要氧化铝比硅胶稍多。目前国内外市场有预先制好的薄层板，底板用玻璃、塑料、铝片等。可按需要用玻璃刀划割，也有用剪刀剪成所要的大小，使用方便，价格贵些。3．特殊薄层的制备根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。（1）酸、碱薄层和pH缓冲薄层为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液（如0.1~0.5N草酸溶液）代替水制成酸性氧化铅薄层使用。硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液（如0.1~0.5N氢氧化钠溶液）代替水制成碱性的硅胶薄层。可用醋酸钠、磷酸盐等不同pH的缓冲液代替水铺层，制成一定pH缓冲的薄层。羧甲基纤维素钠溶液一般用0.5~1%浓度，宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制得的薄层表面较为细腻平滑。常用0.8%浓度。CMC-Na系中粘度、300~500厘泊（粘度单位）。CMC-Na系碳水化合物，调制时应在水浴上进行。活化温度不应过高，防止碳化。（2）络合薄层硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5~25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，再按常法铺成薄层，制成薄层避光阴干，于105℃活化半小时后避光贮存。制成的薄层以不变成灰色为好，在三天内应用。也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液，把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干，按上法活化，贮存。（二）吸附剂的活度测定1.氧化铝活度的测定一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。染料试剂的配制：取偶氮苯（Azobenzene）50mg，对甲氧基偶氮苯（P-Methoxyuzobenzene）,苏丹黄（SudanI,Benzeneazo-β-naphthol），苏丹红（SudanⅢTetrazobenzol-β-naphthol），对氨基偶氮苯（P-Aminoazobenzene）各20mg，分别溶于50ml重蒸馏的四氯化碳（经氢氧化钠干燥）中。常法制备不含粘合剂氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3cm处间隔1cm左右轻轻点上5个可以看清的小点。各吸取约0.02ml染料试剂分别点于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10~40°之间，展开后测出各斑点的Rf值，从表1确定氧化铝的活度（一般高活性氧化铝Ⅰ~Ⅲ级活度使用本法时，结果往往偏低）。另取不含粘合剂氧化铝薄层板一块，置于水蒸汽饱和容器内，2~3小时后取出，按上述方法测定活度。观察有无变化。2．硅胶活度的测定一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄（Dimethy-yellow.P-Dimethylaminoazobenzene）、苏丹红（SudanⅢ）、靛酚蓝（Indophenolblue4-Tapnthoquinone-4-dimethylaminoaniline）的苯溶液各10μl点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10cm（约20分钟），三种染料应明显分离。靛酚蓝斑点接近于起始线，二甲基黄斑点在薄层的当中，苏丹红斑点在两斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：硅胶G（G是Gypsum石膏的缩写，表示加了石膏），硅胶H（H表示不加石膏），硅胶GF254（F254表示加石膏和在波长254nm处显绿色荧光的硅酸锌锰），硅胶GF365（表示加石膏和在波长365nm处显黄色荧光的硫化锌镉）。氧化铝则类推。表1氧化铝活度与偶氮染料比移值关系偶氮染料氧化铝活度级Rf值二级三级四级五级偶氮苯0.590.720.850.95对甲氧基偶氮苯0.160.450.690.89苏丹黄0.020.250.870.98苏丹红0.000.100.350.50对氨基偶氮苯0.000.050.080.19（三）薄层层析的应用薄层层析法在中草药化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。用薄层层析进行中草药化学成分检识，可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。由于在薄层上展开后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠，不仅可通过显色获知成分类型，而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。例一：湖北贝母生物碱成分的TLC检识吸附剂：硅胶CMC-Na薄层样品：湖北贝母总生物碱氯仿溶液展开剂：C6H6-EtOAc-NHEt2（6：4：1）显色剂：改良碘化铋钾喷雾例二：丹参色素的TLC检识吸附剂：硅胶G-CMC-Na板样品：丹参乙醚提取液展开剂：石油醚-乙酸乙酯（9：1）记录TLC结果五、问题与讨论1.硅胶、氧化铝、聚酰胺各适合于分离哪些类型的化合物？2.什么是制备薄层？简要写出其操作过程。3.什么是边缘效应？怎样产生的？如何克服？实验二粉防已生物碱的提取分离与鉴定一、实验目的要求1．掌握生物碱的一般提取方法。2．用低压柱层析分离、纯化单体的方法及薄层层析鉴定二、实验原理汉防己为防己科千金藤属物StephaniatetrandraS.Mcore的根，是祛风解热镇痛药物，其有效成分为生物碱，主要是汉防己甲素和汉防已乙素。临床上除用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外，还将粉防已生物碱的碘甲基或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用。此外，汉防已甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用。汉防已根中总生物碱含量为1.5~2.3%，主要为汉防已甲素，含量约1%；汉防已乙素，含量约0.5%；轮环藤酚碱，含量为0.2%；以及其它数种微量生物碱。1.汉防已甲素（Tetrandrine，汉防已碱，粉防已碱）无色针晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中，可溶于苯。Mp216℃，有双熔点现象，自丙酮中结晶者，150℃左右熔后加热又固化，至213℃复熔。NOCH3OROCH3OCH3ONCH3CH3HHR=C