实时定量 PCR在基因表达研究中的应用_oct 医药

实时定量PCR在基因表达研究中的应用——完整优化的实验流程设计pictureplaceholderRocheAppliedScience,Oct.2011PCR定量原理荧光定量PCR常规PCR实验目的起始模板量扩增后的产物总量检测时间点扩增时平台期实时荧光PCR−实时荧光信号检测−数学分析3目标基因拷贝数多=反应很早开始进入指数增长=Cq值小实时定量PCR的定量分析：定量原理Cq值与模板初始浓度存在负相关的数学关系Ct/CpSampleASampleB4•目的：–在复杂的基因表达背景中定量检测mRNA的微量变化–获得稳定的，可重复的实验数据基因表达分析——相对定量转录翻译qPCR行业质量标准由业内专家制定大纲•实时定量PCR荧光信号检测方法-探针法-染料法•简化方法学验证——使用预混的反应液•准确的数学计算方法•MIQE：完整的实验流程设计6检测方法－荧光染料•SYBRGreenI–不依赖于序列–不饱和dsDNA结合染料–激发:488nm;发射:533nm–在扩增循环（延伸）和熔解曲线过程中检测AnnealingElongationEndofElongation退火延伸结束时延伸熔解曲线分析检测方法－荧光染料65°C——95°C温度缓慢上升检测方法－探针•水解探针(HydrolysisProbes):TaqManProbes–荧光报告基团与淬灭基团–聚合酶的5’核酸酶活性将荧光素从探针上释放–在扩增循环（延伸）中检测信号延伸结束延伸变性退火Example:FAMExc.465nmEmi.510nm淬灭剂检测实时定量PCR方法设计要点•实时定量PCR荧光信号检测方法-探针法-染料法•简化方法学验证——使用预混的反应液•准确的数学计算方法•MIQE：完整的实验流程设计10方法设计有效？OR11适合于Roche实时荧光系统的预混试剂LightCycler®480ProbeMaster(LightCycler®480系统专用试剂)LightCycler®TaqManMaster(LightCycler®Carousel-based系统专用试剂)12适合于非Roche实时荧光系统的预混试剂需要ROX校正的仪器使用：FaststartUniversalSYBRGreenMasterMix(ROX)FaststartUniversalProbeMasterMix(ROX)无需ROX校正的仪器使用：FaststartSYBRGreenMasterFaststartTaqManProbeMaster13ROX染料及其浓度对结果的影响一般情况下，ROX浓度必须进行优化ROX浓度太低：信号不稳定，曲线不光滑，Ct值出现波动ROX浓度太高：使扩增信号变弱，Ct值变高经过ROX校正的曲线ROX的作用是：①校准光程差②校准加样误差FUMM，SYBRGreenI法FUMM，探针法•2×预混试剂•特殊优化的buffer：通用ROX染料、Mg2+•FastStartTaq热启动酶•高纯度dNTPs•预含dUTP，可进行尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）反应，消除交叉污染•(SYBRGreenI)FastStartUniversalqPCRMasterMix（FUMM）14所有需要ROX校正的荧光定量PCR平台适用于难扩增情况：可扩增500bp的片段、以及GC-或AT-富含区域FastStartUniversalProbeMaster(ROX)A公司实时荧光预混试剂Example1：CycA长片段扩增,440bp探针法平台：AB7900HTReal-timePCRSystemExample2•基因：GC-poorassay―ß-globin‖•SYBRGreenI•平台：AB7900HTReal-timePCRSystem16FastStartUniversalSybrGreenIMaster(ROX)基因：APO(GC—富含)，探针法平台：Mx3000PFSUniversalProbeMaster(Rox)A公司实时荧光预混试剂SampleKonzentrationCtMittelwertAPOGCreich50ng26,4627,2027,3827,025ng30,2230,3630,5030,360,5ng33,7233,3033,0033,34SampleKonzentrationCtMittelwertAPOGCreich50ng28,0227,9827,9227,975ng31,3231,0331,7131,350,5ng35,0134,4034,7634,72Example3室温长时间放置后的实验结果，即用型试剂及其稳定性大大方便了反应液的配置过程高质量试剂，室温下依然稳定AB7900HTReal-timePCRSystemExample:APO(GC-rich)，HydrolysisProbeFormat0hours48hours24hours12hoursQuantity0h12h24h48h5025.125.024.825.0528.728.628.228.70.532.032.132.032.2NTCUndet.Undet.Undet.Undet.简化方法学验证FUMM（SYBRGreenI，探针法）——简便、省时、准确•FastStartTaq热启动酶：化学修饰，非抗体修饰•特殊优化的buffer•高纯度dNTPs19即用、无需优化、稳定通用于所有实时荧光PCR平台通用于所有模板引物、探针的方法学评价指标：扩增反应的灵敏度特异性重复性扩增效率实时定量PCR方法设计要点•实时定量PCR荧光信号检测方法-探针法-染料法•简化方法学验证——使用预混的反应液•准确的数学算法•MIQE：完整的实验流程设计2021相对定量Step1:同一样品中，获得目的基因和参比基因的表达水平Step2:不同样品中模板含量引起的定量差别由参比基因校正参比基因可以修正不同样品中：•起始量的差别•核酸回收率及质量的差别•可能的RNA降解•cDNA模板移液误差（目标基因浓度）（参比基因浓度）相对比率22参比基因的选择•理想的参比基因:–表达水平在所有样品中是持续稳定的：正常组织vs.肿瘤组织–表达水平不受实验条件变化的影响：处理样本vs.未处理的样本•看家基因(Housekeepinggenes)：编码有基础细胞功能的蛋白质使用2-3个看家基因，将结果综合作为参比基因24•使用校准品样品(calibrator)对最终分析结果进行进一步的均一化–不同样品之间的直观比较–校正不同次实验间以及不同批号试剂的差异–不同实验室结果相互比较校准品的选择基因相对表达水平目的基因（Targetgene）相对表达水平计算25T=100T=10T=10=2=2=0.2R=50R=5R=50正常细胞，作为校准品校准后：1细胞样品1，经处理校准后：1细胞样品2，经处理校准后：0.126校准品的选择•通常的校准品样本：–未处理的细胞系–起始时间点的样本–正常组织样本•制备校准品的建议：–实验从始至终使用同一校准品–在实验最开始的时候制备高质量的cDNA，分装，-20℃保存27N=NoxECq使用校准品的相对定量目的基因和参比基因的扩增效率（Efficiency）ET=ER=100%???28简单相对定量方法•默认扩增效率E=2，(-ΔΔCq)方法CalibratorNormalizedRatio=2CqT(C)–CqT(S)x2CqR(S)–CqR(C)=2[CqT(C)-CqR(C)]-[CqT(S)-CqR(S)]=2[ΔCq(C)-ΔCq(S)]=2-ΔΔCq•适用于：—对精确度要求不太高—实验优化完备29PCR反应扩增效率的重要性•PCR扩增效率的差异存在于：–不同模板及引物设计的差异–不同的PCR体系–不同次的PCR实验CrossingPointLogConcentration样品1样品2效率＝2的标准曲线效率偏离2的标准曲线E=10-1/slopePCR扩增效率对定量结果的影响DetectionCycle(n)101520253035PCREfficiency2.00------1.9716%25%35%46%57%70%1.9529%46%66%88%113%142%1.9067%116%179%260%365%500%1.80187%385%722%1290%2260%3900%1.70408%1045%2480%5710%13000%29500%1.60830%2740%8570%26400%80700%246400%ErrorCalculation(2n/En-1)x100PCR效率和循环数对分析误差的影响31高级相对定量方法•通过标准曲线对扩增效率修正•标准曲线–不需要已知样品浓度–对样品做梯度稀释CrossingPointLogConcentrationE=10-1/slope最为准确的相对定量结果32建立标准曲线的意义线性范围扩增效率灵敏度重复性PCR抑制物•实时定量PCR荧光信号检测方法-探针法-染料法•简化方法学验证——使用预混的反应液•准确的数学计算方法•MIQE：完整的实验流程设计大纲33完整的流程样品制备核酸分离样本采集生物变异处理和保存方法浓度、纯度完整性酶反应抑制物完整的流程–RNA模板制备•核酸抽提纯化细胞裂解、胞内核酸酶灭活、目标核酸的分离TriPure–基于溶液技术−对样本量没有限制−RNA、DNA、蛋白抽提−片段完整−实验技巧要求苯酚、异硫氰酸胍氯仿抽提醇沉淀完整的流程–RNA模板制备HighPure–硅吸附技术−中小规模抽提−柱上DNase处理−步骤简化−操作快捷−标准化高离液盐，乙醇，低pH硅胶膜离心柱完整的流程–RNA模板质量检验•A260和A280检测：纯度（A260/A280:1.7–2.0）浓度计算•电泳检测：完整性、回收率•扩增检测：是否有基因组DNA残留是否有PCR抑制物严格抑制核酸酶作用•ProtectorRNaseInhibitor操作过程中应用核酸酶抑制剂提高抽提模板质量•RNA保存：-70~-80℃完整的流程样品制备核酸分离逆转录样本采集生物变异处理和保存方法浓度、纯度完整性酶反应抑制物模板量引物、浓度酶反应温度和时间完整的流程–cDNA合成要点•实验目的–高产量–高灵敏度–还原真实的模板浓度•Transcriptor1stStrandcDNASynthesisKit–反应温度：42-65℃，RNA模板二级结构–ProtectorRNaseInhibitor，高温耐受–直接用于高GC含量、茎环结构的RNA模板–无PCR反应抑制作用–RNaseH活性–结合高灵敏度–线性动态范围Transcriptor提高反应温度RNaseH（+）对后续PCR反应没有影响宽泛的线性范围和高灵敏度M-MuLV完整的流程–cDNA合成要点WithFastStartUniversalMasterMix（SYBRGreenI）Oligo(dT)12–18锚定Oligo(dT)18–反转录全长cDNA,至14kb随机6聚体引物–克服二级结构的影响–非poly(A)+tail模板反转录完整的流程–反转录引物选择完整的流程样品制备核酸分离逆转录扩增检测对照参比基因校准品数据分析样本采集生物变异处理和保存方法浓度、纯度完整性酶反应抑制物模板量引物、浓度酶反应温度和时间检测方法扩增效率重复样本实例——设计一个完整精确的基因表达定量实验ResearchExampleRelativeQuantificationofMultiplemRNATargetsandReferenceGenesinSpinocerebellarAtaxia研究地点：UniversityofTübingen,Germany研究目的：针对可能与小脑萎缩症相关的16个转录子，研究它们在疾病进程中的表达情况研究样本：88个小脑萎缩症病人的血液样本，分组为轻度、中度和重度失调上游工作：决定研究内容——目的基因和样本（校准品）44设计一个完整精确的基因表达定量实验实验设计和流程：RNA提取