组织学技术与免疫组化

1移液器的使用与校准实验用移液器的使用移液器基本上替代了过去的玻璃刻度吸管，作为一种方便有效的精密计量器材已广泛用于各类实验。基本原理：依靠活塞的上下移动实现吸液和放液。科研人员的基本功，是科学实验的第一步，熟练掌握是保证实验结果正确可靠的前提和条件。目前实验室常用的移液器主要有空气移液器，活塞正移液器，多道移液器以及电子移液器。[Imageinformationinproduct]Image:Notetocustomers:ThisimagehasbeenlicensedtobeusedwithinthisPowerPointtemplateonly.Youmaynotextracttheimageforanyotheruse.实验用移液器的使用正确的安装错误的安装卸掉Tip头•Tip头的安装和卸掉实验用移液器的使用1.移液之前，要保证相同温度。吸取液体时，保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3毫米。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）切忌Tip头在液体里吹泡泡。一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体。移液的方法实验用移液器的使用移液器在不同使用情况下的存在的问题从大体积调节至小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可，从小体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，可保证最佳的精确度。（见图1）实验用移液器的使用你的移液器准确吗？？-------移液器的精准性检测？不同量程范围的移液器的校准方法1μl应用分光光度计检测≥1μl用精密分析天平测定重量1-10μl从预装蒸馏水的称量管中取出一定量蒸馏水，进行扣除计算的方法称量10μl用预润的吸头将蒸馏水加入称量管中的方式称重，多道移液器用预润的吸头加入称量管中的方式称重，每一通道都要进行校准（根据水在20℃时的密度0.9982计算体积）实验用移液器的使用你的移液器准确吗？？-------移液器的精准性检测？移液器允许误差和测量的重复性标容量/uL检定点/ul容量允许误差±（%）测量重复性≤（%）0.1201010.5201011260.2201021126212611261058410842126201084204210841005031.5100212042200100212001.5110021100050010.5100010.5实验用移液器的使用实验材料仪器：电子天平试剂：蒸馏水移液器(P1000/P200/P20)尖端管（枪头）(1000ul/200ul)小量杯实验用移液器的使用实验步骤实验前的准备工作1、选择1000P、200P、20P的移液器。2、反复练习怎样使用移液器。3、将小量杯放到电子天平中，并将天平调零。实验用移液器的使用实验步骤1、调节微量移液器，使读数显示为所要取液体的体积。2、吸取液体。3、将吸取的液体放入称量瓶中。4、观察电子天平，并记录数值。5、每次用天平读取数值后要清零。6、按下吸液管活塞下侧的按钮，将尖端管退到垃圾桶中。实验用移液器的使用实验结果计算：容量允许误差±（%）【（平均体积-理想体积）/理想体积】X100测量重复性≤（%）【（测量体积-平均体积）/平均体积】X100实验用移液器的使用移液器允许误差和测量的重复性标容量/uL检定点/ul容量允许误差±（%）测量重复性≤（%）0.1201010.5201011260.2201021126212611261058410842126201084204210841005031.5100212042200100212001.5110021100050010.5100010.5实验用移液器的使用禹晓童，杨燕琳，陈栎北京大学第三医院中心实验室2016-12-3组织学技术及免疫组织化学中心实验室组织病理学分析平台平台设备工作内容地点办公电话组织病理学技术和形态学分析全套先进的病理切片制作和图像分析设备协助研究生和科研人员进行组织病理学相关的实验设计、技术指导和服务科研楼8楼010-82266350全套病理分析设备专业技术人员黄琛讲师，博士，博士后专业：病理学与病理生理学。主要从事干细胞生物学、肿瘤病理学与肿瘤基因组学、基因芯片生物信息学分析等方面研究。杨燕琳主管技师专业：病理学技术。负责病理学教学、科研和外检。陈栎技士负责科研临床病理制片及免疫组化。禹晓童技师专业：病理学与病理生理学。负责临床病理制片及免疫组化、特殊染色。免疫组织化学技术特殊染色免疫组织化学技术第一个问题：为什么选择采用免疫组织化学技术这种实验方法？导师安排课题研究A因素与B疾病/病变/状态的关系KeywordsA因素B疾病/病变/状态相互关系冠状动脉粥样硬化α-平滑肌肌动蛋白查文献、看综述B疾病/病变/状态A因素A因素是什么与类似疾病或病变的关系定义病因病理和分类临床表现疾病分期辅助检查诊断和鉴别诊断治疗和预后DNAmRNA蛋白质A因素A因素是什么类似疾病或病变中的变化DNAmRNA蛋白质DNA基因序列单一基因？家族？是否存在亚型？单核苷酸多态性(SNP)碱基突变染色体定位DNA基因序列单一基因？家族？是否存在亚型？染色体定位NCBI检索DNA基因序列单核苷酸多态性(SNP)碱基突变高通量检测低通量检测微阵列芯片高通量测序PCR后，SSCP、RFLP、测序原位杂交实时荧光定量PCR-SNP基因分型分析少样本，多基因初筛多样本，单基因mRNA剪接变异体表达量高通量检测低通量检测微阵列芯片高通量测序原位杂交RT-PCR少样本，多基因，初筛多样本，单基因实时荧光定量PCR蛋白表达量细胞内定位改变翻译后修饰蛋白检测原理：将待测的目标蛋白当作抗原，采用特定的商品化抗体，以抗原-抗体结合的免疫反应为原理，使抗体与待测目标蛋白结合，再利用显色剂、荧光指示剂等方式，显示蛋白的表达量或定位。WesternBlottingFCMELISA免疫组化免疫荧光蛋白表达量细胞内定位改变翻译后修饰细胞内定位改变WesternBlotting细胞、组织定性、定量FCM悬浮细胞定性、定量同时检测多个指标ELISA细胞液、上清液、组织液定量免疫组化免疫荧光免疫组化免疫荧光原位、定性、定量（光密度、阳性细胞表达率）可双染原位、定性、定量（阳性细胞表达率）、可双染WesternBlotting免疫组化有时，免疫组化的差异在WB中无法体现。中心法则(CentralDogma)单核苷酸多态性碱基突变剪接变异体表达量表达量细胞内定位改变翻译后修饰PCR后，SSCP、RFLP、测序RT-PCR、定量PCRWesternBlotting原位杂交原位杂交FCMELISA免疫组化免疫荧光荧光定量PCR阶段性总结免疫组织化学技术(IHC)原位蛋白质检测技术，以免疫学抗原抗体反应为原理，运用物理和化学方法显示抗原-抗体反应结果，形成可见的最终有色产物，在对组织、细胞进行传统形态学观察的同时，对组织和细胞内特定蛋白质进行定位、定性、定量检测。原位蛋白质检测抗原抗体反应物理和化学方法显示反应结果，形成可见产物形态学观察定位、定性、定量抗原抗体反应抗原（antigen，Ag）：能启动机体免疫应答，并与其应答产物结合，发生一系列生物学效应的物质。特征•免疫原性：引起抗体形成的能力。•反应原性：可与其诱发生成的相应抗体发生特异性结合反应。•耐受原性：在一定条件下又可以阻碍抗体的形成。待测蛋白=抗原组织切片细胞爬片抗原抗体（antibody，Ab）：机体受到抗原刺激，通过体液免疫应答，B细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌仅与该抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。第一抗体(一抗)商品化抗体多克隆抗体单克隆抗体多克隆抗体(polyclonalantibody，pAb)血清抗体，是机体接受抗原主动或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。分泌抗体抗原注射入动物体内1抗原激活B细胞抗原B细胞2形成记忆性B细胞克隆3a形成浆细胞克隆3b抽取含有抗体的血清，分离、纯化后获得多克隆抗体5生成来源于不同B细胞的多克隆抗体4单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)mAb由一个杂交瘤细胞克隆产生，只针对一个抗原决定簇，所有抗体分子在结构上完全一致，具有高度特异性和稳定性。抗原注射入动物体内1脾脏2分离脾脏B细胞人骨髓瘤细胞融合3B细胞与体外培养的人骨髓瘤细胞株融合选择性细胞培养基培养杂交瘤细胞存活B细胞和人骨髓瘤细胞死亡45杂交瘤A杂交瘤B杂交瘤C杂交瘤D单个杂交瘤细胞形成克隆6mAbAmAbBmAbCmAbD单个杂交瘤细胞克隆分泌单克隆抗体物理和化学方法显示反应结果，形成可见产物•能与抗体形成牢固的共价键结合•不影响抗原抗体结合•具有信号放大效应•发光或显色反应主要发生在抗原一抗体结合原位，并与周围有较高对比度。标记物抗原抗原抗体结合形成Ag-Ab复合物本身不可见，必将抗体加以标记，利用标记物发光，或与其他物质的反应才能形成可见发光或显色。一抗辣根过氧化物酶HRP碱性磷酸酶AP葡萄糖氧化酶GOD优点穿透力强，稳定，特异性高，不溶性好底物多，敏感性高，显色时间范围宽终产物稳定，易永久保存缺点特异性受内源性过氧化物酶影响分子大，穿透力弱，受内源性AP干扰分子大，穿透力弱，与底物反应敏感性低适用范围IHC，WB原位杂交，双重酶标IHC，原位杂交，WB，ELISA等显色剂DAB(棕黄)，AEC(红，水溶性封片剂)BCIP/NBT(蓝)，快蓝(蓝)，快红(红)，水溶性封片剂NBT，TNBT，INT常用抗体标记酶标记物显色荧光标记物异硫氰酸荧光素(FITC)异硫氰酸罗丹明(TRITC)Cy3Cy5标记物发光+二抗标记物1标记物与二抗结合标记的二抗抗原一抗+2一抗与抗原结合3二抗与一抗结合4标记物自发光或显色选择一抗选择二抗系统选择显色剂选择一抗选择二抗系统选择显色剂5S原则•Specificity：特异性，最重要•Sensitivity：敏感性•Simplicity：简便性•Safety：安全性•Save：省时省钱选择一抗选择二抗系统选择显色剂1.抗体公司网站，查询抗体不建议选择羊来源的一抗做免疫组化，不建议使用santacruz公司的抗体说明书明确写出可做石蜡标本2.下载抗体说明书，仔细阅读，选定一抗抗体来源QuantitysizeBackgroundSpecificityFormatApplicationContentsStorageReference来源动物种属单克隆？多克隆？够用？浪费？蛋白功能细胞定位IgG？IgM？反应种属液体？粉末？可用于的检测方法、参考浓度范围抗体产生方式温度时间使用该抗体的文章选择一抗选择二抗系统选择显色剂抗体来源QuantitysizeBackgroundSpecificityFormatApplicationContentsStorageMouse单克隆100μl胞浆蛋白IgG大鼠、人液体IHC,50-500腹水4℃1年Mouseanti-α-smoothmuscleactin，BM0002，博士德选择一抗选择二抗系统选择显色剂DAKO,Envision系统中杉,PV-600系统抗体来源反应动物种属反应的球蛋白种类标记物标记酶来源动物种属与一抗来源的动物反应生物素？0.001-0.01g/L卵白素去除内源性生物素IgG？IgM？HRP？AP？过氧化氢去除内源性过氧化物酶即用型工作液反应底物溶液中加入左旋咪唑，抑制内源性AP活性选择一抗选择二抗系统选择显色剂中杉,PV-6002抗体来源反应动物种属反应的球蛋白种类标记物标记酶SheepMouseIgGHRP过氧化氢去除内源性过氧化物酶选择一抗选择二抗系统选择显色剂AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)DAB(二氨基联苯胺)HRP在过氧化物酶的催化下，电子供体AEC生成稳定的红色产