色谱-质谱联用

1色谱-质谱联用技术及其应用福州大学测试中心卢巧梅2011.10.182授课内容色谱技术质谱技术气相色谱-质谱联用技术液相色谱-质谱联用技术3概述色谱：化合物分离质谱：纯物质结构分析色谱-质谱联用：结合共同优点GC-MS；LC-MS；CE-MS关键点：接口技术m/z152943578599113142714色谱法由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来含义，但仍被人们沿用至今。一色谱技术5色谱的原理定义：色谱是一种把混合物中多组分分离的实验技术。即利用物质的物理化学性质建立的分离分析方法。实质：分离目的：定性或定量分析6固定相和流动相填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。7按分离机理分类分配色谱：利用在流动相和固定相中分配系数的不同分离；吸附色谱：利用物理吸附性能的差异分离；离子交换色谱：利用离子交换能力的差别分离；空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同分离…在常用的色谱中，常是几种分离机制共同作用的结果。注意89色谱法的流出曲线及有关术语10色谱峰所能提供的重要信息1样品中所含组分的最少个数2保留值---定性分析3色谱峰面积（或峰高）---定量分析4色谱峰的保留值和区域宽度---评价色谱柱的分离效能5根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件11二质谱技术•质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比（m/z）的测定来进行分析的一种方法。•被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场运动行为的不同，把离子按m/z分开而得到质谱，并得到样品的定性定量结果。m/z15294357859911314271122.1质谱的发展40年代同位素测定和无机元素分析50年代有机物分析60年代气相色谱-质谱联用80年代新的质谱技术接口技术（基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源）新质谱仪（液相色谱-质谱联用仪，富立叶变换质谱仪等）目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。1911年世界第一台质谱装置（J.J.Thomson）70年代计算机技术引入13◆质谱不属波谱范围；◆质谱图与电磁波的波长和分子内某种物理量的改变无关；◆质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱,谱图与分子结构有关；◆质谱法进样量少,灵敏度高,分析速度快；◆质谱法可提供分子量,确定分子式。2.2质谱特点14质谱仪是通过对样品电离后产生的具有不同的m/z的离子来进行分离分析的。质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析系统和检测系统。2.3质谱仪的基本结构计算机数据处理系统真空系统加速区进样系统离子源质量分析器检测器15质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度。2.3.1真空系统二级真空系统！16真空系统为早期的维护反馈提供数字化控制双分子涡轮泵可快速抽真空和进行稳定操作17进样系统目的是高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。进样方式：1直接进样2仪器联用的进样（GC、LC、CE）2.3.2进样系统18离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。2.3.3离子源Note：1.质谱检测的是离子；2.离子源=接口19电子轰击电离ElectronImpactIonization,EI化学离子化ChemicalIonization,CI场电离，场解吸FieldIonizationFI,FieldDesorptionFD快原子轰击FastAtomBombardment,FAB基质辅助激光解析电离Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI电喷雾电离ElectrosprayIonization,ESI大气压化学电离AtmosphericPressureChemicalIonization,APCI离子化方法20电子轰击电离EI•EI源应用最为广泛，它主要用于挥发性样品的电离。•原理：由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。•所有的标准质谱图都是在70eV下做出的。有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。•由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以得到化合物的结构信息。2122有些化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子；为了得到分子量可以采用CI电离方式。特点：最强峰为准分子离子；谱图简单；不适用难挥发试样；++气体分子试样分子+准分子离子电子(M+1)+;(M+17)+;(M+29)+;化学电离（CI）23化学电离CI反应气体可以是甲烷、异丁烷、氨等。以CH4为例：CI源工作过程中要引进一种反应气体。气体经过电子轰击，产生离子，再与试样相互碰撞，产生准分子离子。CH4+·+CH4→CH5++CH3·(48%)CH3++CH4→C2H5++H2(41%)CH2+·+2CH4→C3H5++2H2(6%)······CH5+,C2H5+,C3H5+等为稳定的次级离子。CH4+·+CH4→CH5++CH3·(48%)CH3++CH4→C2H5++H2(41%)CH2+·+2CH4→C3H5++2H2(6%)······CH5+,C2H5+,C3H5+等为稳定的次级离子。CH4+eCH4++CH3++CH2++CH++C++H+在电子轰击下，甲烷首先被电离:CH4+eCH4++CH3++CH2++CH++C++H+在电子轰击下，甲烷首先被电离:甲烷离子与分子进行反应，生成加合离子：24M+CH5+→[MH]++CH4M+C2H5+→[MH]++C2H4M+C2H5+→[MH]++C2H6加合离子与样品分子反应：准分子离子[QM]+生成的[M+H]+和[M-H]+比样品分子M多一个H或少一个H，称为准分子离子。化学电离源是一种软电离方式，有些用EI方式得不到分子离子的样品，改用CI后可以得到准分子离子，因而可以求得分子量。25场致电离特点：强电场将分子中拉出一个电子；分子离子峰强；碎片离子峰少；不适合化合物结构鉴定；阳极+++++++++++++阴极d1mm不足：要求样品分子处于气态，灵敏度不高，应用逐渐减少。以场电离FieldIonization（FI）为例26快原子轰击（FAB）氩气在电离室依靠放电产生氩离子，高能氩离子经电荷交换得到高能氩原子流，氩原子打在样品上产生样品离子。电离过程中不必加热气化，因此适合于分析大分子量、难气化、热稳定性差的样品。例如肽类、低聚糖、天然抗生素等。FAB源主要用于磁式双聚焦质谱仪FAB是目前广泛使用的软电离技术，得到的质谱不仅有较强的准分子离子峰，而且有较丰富的结构信息。27MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到准分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少.基质辅助激光解析电离(MALDI)28ESI是近年来出现的一种新的电离方式。它主要应用于液相色谱-质谱联用仪。流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；从而雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子进入后端检测。电喷雾电离（ESI）29ESI是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的有机化合物。ESI的最大特点是容易形成多电荷离子。目前采用电喷雾电离，可以测量大分子量的蛋白质。30大气压化学电离源(APCI)APCI喷嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。CoronaNebulizerAPCIHPLCinlet+++++31APCI主要用来分析中等极性的化合物。有些分析物由于结构和极性方面的原因，用ESI不能产生足够强的离子，可以采用APCI方式增加离子产率，可以认为APCI是ESI的补充。APCI主要产生的是单电荷离子，很少有碎片离子，主要是准分子离子。以上两种电离源主要用于液相色谱-质谱联用仪。32各种离子源的相对适用性33◆质量分析器是质谱仪的核心,质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序分开并排列。◆不同类型的质量分析器构成不同类型的质谱仪。◆不同类型的质谱仪其功能，应用范围，原理，实验方法均有所不同。2.3.4质量分析器34单聚焦磁场分析器在一定的B、V下，不同m/z的离子其R不同，由离子源产生的离子，经过分析器后可实现质量分离。离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转改作圆周运动。其运动轨道半径R可由下式表示：上式中，m-离子质量Z-离子电荷量V-离子加速电压B-磁感应强度35单双聚焦质谱仪体积大；色谱-质谱联用仪器的发展及仪器小型化（台式）需要体积小的质量分析器：四极杆质量分析器飞行时间质量分析器离子阱质量分析器体积小，操作简单；分辨率中等；36四极杆质量分析器四极杆质谱结构简单，价廉，体积小，易操作，扫描速度快，适合于GC-MS,LC-MS,但分辨率不高。+ElectronBeamABCSampleinIonBeam37飞行时间质谱仪（TimeofFlightMS,TOF-MS）TOF-MS的核心部分是一个无场的离子漂移管；加速后的离子具有相同的动能zVmv2212/1)2(mzVvm/z小的离子，漂移运动的速度快，最先通过漂移管;m/z大的离子，漂移运动的速度慢，最后通过漂移管。适合于生物大分子，灵敏度高，扫描速度快，结构简单，分辨率随m/z的增大而降低。38FT-MS的核心为分析室，分析室由三对平行的极板构成。磁力线沿z轴方向，离子的回旋运动垂直于z轴，在与x轴方向垂直的两极板上施加激发射频，在与y轴方向垂直的两极板上检测信号。(FourierTransformioncyclotronresonanceMassSpectrometer,FTICR-MS)傅立叶变换离子回旋共振质谱仪39离子阱质量分析器特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；402.3.5检测系统质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器,经接收放大后被记录。41质谱仪的检测主要使用电子倍增器，也有的使用光电倍增管。由倍增器出来的电信号被送入计算机储存，这些信号经计算机处理后可以得到色谱图，质谱图及其它各种信息。422.4质谱术语基峰：RI100,质荷比：m/z,z=1,z=2;m的计算：组成离子的各元素同位素的质子和中子之和。精确质量:基于天然丰度最大的同位素的精确原子量如：1H1.007825、12C12.000000、14N14.003074、16O15.994915·····精确度与质谱计的分辨率有关。43m/z丰度基峰:谱图中最强的离子[M+H]+假分子离子或准分子离子A+1A+2来源于自然界中同位素{横坐标为