实验八酶免疫技术(精)

实验六酶免疫技术实验目的掌握ELISA试验的原理、方法、操作步骤实验内容1.静脉采血2.ELISA法检测乙肝标志物酶标记免疫技术又称酶免疫技术：抗原抗体反应的特异性酶促反应的专一性基本原理：Ab+EAb-E+AgAgAb-E+底物显色Ag+EAg-E+AbAgAb-E+底物显色该实验可对标本中抗原（抗体）进行定性、定位和定量分析。相结合的技术敏感性高特异性高不需特殊备酶免疫技术分类酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定聚苯乙烯为固相载体其他固相载体——ELISA琼脂糖珠为固相载体ELISA法检测乙肝标志物一、原理：1.双抗体夹心法2.双抗原夹心法3.竞争法双抗体夹心法测抗原阳性阴性EEEEEEEEE竞争法测抗原阳性阴性EEEEEEE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合E二、试剂有五种试剂盒，对应五种HBV标志物1、酶联反应板，聚苯乙烯固相载体，已包被妥已知抗原或抗体。2、酶标记物：HRP标记的已知抗体或抗原。3、显色剂：分A、B两种，分别是MTB和H2O2。为HRP作用的底物。4、对照品：阳性对照血清、阴性对照血清、质控血清。5、其他试剂：如竞争法的标准抗原或抗体等。6、终止液：0.2M的硫酸溶液。7、洗涤剂：一般为PB加非离子型表面活性剂。双抗体夹心法基本操作1、固相载体：聚苯乙烯塑料2、包被：取已知抗体加入空白反应板中，置冰箱过夜，次日甩干，洗涤后备用。此为已包被好的反应板。3、加样：取待测样品50μL，加入反应孔内。4、加酶标记物：取酶标记物50μL，加入反应孔内。5、水浴：37度水箱30min。6、洗涤：每孔加满洗涤液，静置15秒，甩出后拍干，连续5次。7、显色：加显色剂A、B液各一滴，水浴15min显色。8、结果观察，肉眼观察可不加终止液，直接观察，如用酶标仪比色，需加终止液50μL于反应孔内，然后上酶标仪。9、注意事项：不同厂家其操作过程各不相同，注意看说明书。如用酶标仪，要设置空白、阳性、阴性，然后计算。操作步骤1、每两人一组，操作时认真看说明书。2、每组分别测定两个组员的标本、阴性对照、阳性对照、空白对照。3、每组均要测定：HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc，共五项4、如图所示排列好反应孔HBsAg抗HBsHBeAg抗HBe抗HBc5、设定测定孔、阴性对照、阳性对照、空白对照。6、加样品、酶标记物。血清竖排加、试剂横着加。标本一标本二阴性对照阴性对照空白对照HBsAg抗HBsHBeAg抗HBe抗HBc7、水浴30分钟，甩干洗涤。每孔加满洗涤液，放置15秒，甩干后拍干，反复5次。8、加显色液A、B每孔各一滴。水浴15分钟。9、观察结果。HBsAg、抗HBs、HBeAg：阳性呈蓝色阴性无色抗HBe和抗HBc：阳性无色阴性呈蓝色大球形颗粒：亦称Dane颗粒小形球颗粒管形颗粒临床意义1．HBsAg：血清中检测到HBsAg，表示体内感染了HBV，因而是一种特异性标志。HBsAg阳性见于：①急性乙型肝炎的潜伏期或急性期（大多短期阳性）；②HBV致的慢性肝病、迁延性和慢性活动性肝炎、肝炎后肝硬化或原发性肝癌等。③无症状携带者。2．抗HBs：表示曾感染过HBV，不论临床上有无肝炎症状表现，均已得到恢复，并且对HBV有一定的免疫力。3．HBcAg与抗HBc：由于HBcAg主要存在于肝细胞核内，并仅存在于Dane颗粒中。因此，对病人血清不能检测HBcAg，而测抗HBc.血清内抗HBc阳性反映：①新近有过HBV感染；②体内有HBV增殖；③有助于诊断急性或慢性乙型肝炎，特别是少数病例就诊时已处于急性恢复期早期，HBsAg已从血中消失，此时血中仅有抗HBc存在，因此，对恢复期患者可作病因追索。4．HBeAg和抗HBe：HBeAg的存在常表示病人血液有感染性。HBeAg阳性揭示病人肝脏可能有慢性损害，对预后判断有一定帮助。抗HBe阳性对病人可能有一定的保护力。HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb简要临床意义阳性（+）阴性（-）阳性（+）阴性（-）阳性（+）俗称“大三阳”，这种情况说明是急、慢性乙型肝炎，传染性极强。阳性（+）阴性（-）阴性（-）阳性（+）阳性（+）俗称“小三阳”，急性HBV感染趋向恢复；慢性HBV携带者，传染性相对较弱。阴性（-）阳性（+）阴性（-）阴性（-）阳性（+）既往感染；急性HBV感染已恢复阳性（+）阴性（-）阳性（+）阴性（-）阴性（-）急性HBV感染早期，传染性强阴性（-）阴性（-）阴性（-）阴性（-）阳性（+）曾感染HBV，急性感染恢复期阴性（-）阴性（-）阴性（-）阳性（+）阳性（+）已感染HBV阴性（-）阳性（+）阴性（-）阴性（-）阴性（-）注射疫苗；或HBV感染已康复阴性（-）阳性（+）阴性（-）阳性（+）阳性（+）既往感染；急性HBV感染恢复期阳性（+）阴性（-）阴性（-）阴性（-）阳性（+）急性HBV感染；慢性HBV携带阳性（+）阴性（-）阴性（-）阴性（-）阴性（-）急性HBV感染早期，HBV携带者阴性（-）阴性（-）阳性（+）阳性（+）阳性（+）急性感染中期阳性（+）阴性（-）阳性（+）阳性（+）阳性（+）急性感染趋向恢复；慢性携带者阳性（+）阴性（-）阴性（-）阳性（+）阴性（-）急性感染趋向恢复阴性（-）阴性（-）阴性（-）阳性（+）阴性（-）急性感染趋向恢复阴性（-）阳性（+）阴性（-）阳性（+）阴性（-）HBV感染已恢复