GMP工程硕士课件生物技术制药个论

生物技术制药个论•基因工程制药•抗体制药•动物细胞制药•植物细胞制药•酶工程制药•现代生物技术改造传统制药工业一、基因工程药物种类蛋白细胞因子药物蛋白类激素溶血栓药物治疗用酶可溶性受体和黏附分子其它核酸DNA药物反义RNA药物RNAi药物核酶细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、凝血因子蛋白质类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。溶血栓药物：组织型纤溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体Ⅰ型其他：血红蛋白、白蛋白等。重组蛋白质类药物核酸类药物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用，它通过纠正突变的基因并使之重新获得适当的功能来治疗或预防疾病。特点是：能将基因表达的产物的作用局限于病变组织周围，从而使治疗更具针对性；只要转化细胞不被清除，转化的因不被抑制，基因表达的产物就可以持续发挥作用。核酸类药物从根本上解决了某些药物的生物原料适应证不断延伸技术含量高加速疑难病症新药物的开发基因工程药物的特点确定研制基因工程药物的技术路线基本技术路线1：获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因组入表达载体受体细胞高效表达动物试验临床试验申报新药证书基本技术路线2：基因组未知功能的人类基因全长cDNA群组入表达载体受体细胞瞬间表达功能初筛功能验证重组蛋白表达体内外药效分析临床前研究临床验证申报新药证书二、研制基因工程药物的关键技术优点：目的明确。缺点：发现新药的机率低，在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。建立在庞大人类基因资源基础上的，具有巨大的开发潜力，缩短新药开发的时间，可大规模增加新药的数量。•宏观：在分子水平上，采用类似于工程设计的方法，按人类的需要产生不同的基因产物或定向的创造生物的新性状，使之稳定地遗传给子代。•微观：将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新性状。——供体、受体、载体•无性繁殖：称之为“克隆”•行使正常功能：称之为“表达”基因工程的定义在体外，将各种来源的DNA片段与载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。–DNA片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的–载体DNA：病毒、细菌质粒或噬菌体生物化学角度：重组载体的操作•上游技术（upstream）----上游技术十分重要–重组子的构建–工程菌的构建及高效表达•下游技术（downstream）-----下游技术更为重要–工程菌大规模发酵最佳参数的确定–新型生物反应器的研制–高效分离介质及装置的开发–分离纯化的优化控制–生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造–超滤、反渗透技术的应用我国现代生物技术与国际水平相比上游技术落后3—5年下游技术落后15年以上基因工程技术工程菌构建流程•选择载体•获得目的基因•目的基因与载体的重组•重组载体的转化•重组子的筛选与鉴定基因工程上游技术基本过程•质粒（plasmid）•噬菌体（phage）•病毒（virus）载体（vector）载体的条件•分子小（10Kb）•有限制酶酶切位点•可自主复制•有足够的copy数•带筛选的标志限制性核酸内切酶restrictionendonuclease•一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶特异核苷酸序列大多为4~6bp回文对称（palindromesequence）–5’GAATTC3’5’GGATCC3’3’CTTAAG5’3’CCTAGG5’宿主细胞原核细胞：细菌、枯草杆菌酵母：酿酒酵母，必赤酵母植物细胞:昆虫细胞：哺乳动物细胞：糖尿病到胰島素治療•ameltingdownoffleshandlimbsintourine.....andthatisthereasonwhythesicknesshasbeencalleddiabetes,asifitwereawinesiphon,becauseliquidisnotretainedinthebody....(ca.81-138A.D.)•1674ThomasWillis發現患者尿液有甜味，稱之“diabetesmellitus”.1776MatthewDobson取患者尿液殘餘物證實為糖。•PaulLangerhans(laterhalfof19thcentury)–describedisletcells-secreteglucoseloweringsubstance•1922BantingandBestdiscoveredinsulin.T-JWuDiscoveryofinsulinBanting&Best-extractedinsulinfromdogs&provedthatitcontrolssymptomsofdiabetesindogs–19211stpatienttoreceivepancreaticextract-14-yroldLeonardThompson.Firstpatienttobenefitfrominsulin–savedfromdeath.胰島素(Insulin)與諾貝爾獎由於首次在人以胰島素成功地控制糖尿病1923諾貝爾獎頒給Banting與Macleod。1955FrederickSanger闡明胰島素結構(A鍊21a.a.與B鍊30a.a.)，1958因此獲得諾貝爾獎。1959SolomonBeson與RosalynYalow開發出免疫測定技術(immunoassaytechnique)，Yalow也於1977獲得諾貝爾獎。B-chainA-chainC-peptides-ss-ss-sManufactureofInsulin•1923-startedmanufacturinginsulin(EliLilly,Novo)•‘MostdevelopmentsininsulintherapyhaveoriginatedfromthelaboratoriesofNovo-Nordisk’–NPHinsulin–highlypurifiedinsulin–monocomponentinsulin–semisyntheticinsulin–biosynthetichumaninsulin•CurrentlyNovoNordiskmanufactureshumaninsulinfrombakers’yeastusingrDNAtechnology；EliLillyproduceshumaninsulinusingE.coli.ImprovementofinsulinQuarlityProblemswithEarlyPreparations•Crude–highlevelsofnon-insulin-likeimpurities–Proinsulin,proinsulinintermediate,covalentinsulindimer•Acidic[pH4-4.3]-painduringinjection•Highincidenceofallergicreactions•Shortdurationofaction(moreno.ofinjections)BetterPurificationmethods•Conventional:isoelectricprecipitationandrecrystallization,Imp:10000-30000ppm•Singlepeak:bygel-filtrationchromatography,(Imp300-3000ppm)•Improvedsinglepeak:byion-exchangechromatography,(50ppm)•Highlypurified:twicechromatographedinsulin,(purifiedto10ppm)•Monocomponent:Imp1ppmHistoryofinsulinpreparations1922:Isolationofinsulin1923:NovoNordiskstartsproductionofinsulin1946:NPH(NeutralProtamineHagedorn)orIsophaneinsulin1961:Firstneutralsolubleinsulin:Actrapid®1964:Firstpremixedinsulin:Mixtard®1973:Monocomponent(MC)purity1982:HumanMonocomponentHM1985:NovoPen®withPenfill®1984:Researchonanalogues胰岛素是由51个氨基酸组成的双链多肽激素，一种可溶性酸性蛋白，分子量为5734道尔顿；每个胰岛素单体包括两条肽链（A、B链），A链含有21氨基酸；B链含有30氨基酸并分别由两个胱氨酸的二硫键连接，多聚体必须裂解成单体才可吸收；呈酸性，等电点为5.3。胰岛素受pH值、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚。Lispro由Lilly公司研发而成，是人胰岛素β链上的第28位的脯氨酸和第29位的赖氨酸位置互换，其他的氨基酸序列和结构没有变化，以单体的形式存在.速效胰岛素----Lispro赖脯胰岛素1999年，Aspart在欧洲上市；2002年在我国上市，是由诺和诺德公司研发的速效胰岛素类似物，人胰岛素β链28位的脯氨酸被天冬氨酸取代，使该胰岛素类似物不易形成六聚体。与Lispro相比，Aspart的吸收速度更快，对餐后血糖的控制、降低糖化血红蛋白效果更好。这种药代动力学的差异可能与它们的等电点不同有关。Aspart对酸化溶液沉淀蛋白的耐受度较高速效胰岛素----Aspart门冬胰岛素是Aventis公司正在研发的一种新型快速作用的胰岛素类似物，β链3位的天冬酰胺被赖氨酸替代，而B链29位的赖氨酸则被谷氨酸取代。速效胰岛素----Glulisine赖谷胰岛素由Aventis公司研发的长效胰岛素类似物，2000年在美国和欧洲上市，于2003年在我国上市。和人胰岛素的区别在于A链羧基端的第21位天冬氨酸被甘氨酸替代，B链C末端加上2个精氨酸残基，。结构改变的结果是改变了胰岛素的等电点，由pH5．4升至6．7，使Glargine在生理pH条件下更难溶解、吸收更为缓慢，六聚体的结合更加稳定，无分泌峰值.长效胰岛素---Glargine甘精胰岛素1115105510152020Asn2530GlyArgArgSubstitutionExtension由诺和诺德公司研制生产，结构上去除了人胰岛素B链29位赖氨酸E位以共价键结合一个N一16～烷酸基的14碳游离脂肪酸，并去掉第30位的苏氨酸残基。与Glargine不同，Detemir溶液在皮下不会形成沉淀，因此吸收速率恒定长效胰岛素---Detemir地特胰岛素基因诊断genediagnosis内在因素（主要是遗传因素）外在因素（环境因素）外在因素+内在因素人类的疾病原因☆临床学诊断☆血清学诊断☆生化学诊断传统的疾病诊断方法◆狭义的概念对疾病或与致病相关的核酸片段（DNA或RNA）的确定及核苷酸序列的测定◆广义的概念对疾病或与致病相关的基因（DNA）的表达产物（mRNA、蛋白质）的确定和序列测定基因诊断的概念基因诊断的特点•针对性强以探测基因为目标，属于“病因诊断”•特异性高以分子杂交技术为基本原理•灵敏度高基因探针带有十分敏感的检测标记，待测标本微量•适应性强基因探针可为任何来源，任何种类，探针序列可为已知亦可未知，检测目标可为特定的基因或基因组合，可为内源基因亦可外源基因，