实验13

实验十三系列实验—测淋巴细胞功能E花环淋转等实验内容•淋巴细胞分离•E花环形成试验（总花环和活性花环）•淋巴细胞转化试验（形态法）•淋巴细胞增殖试验（MTT法）•细胞因子测定（ELISA法）淋巴细胞分离实验原理•淋巴细胞成功分离后，便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于E花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养（需无菌操作）。•淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应有活性。淋巴细胞分离实验原理•分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。淋巴细胞分离实验原理•本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。实验步骤1.取5ml人肝素抗凝血于试管中，加3mlGKN液稀释，手动轻轻摇匀；2.取2ml淋巴细胞分离液（ficoll)加入离心管中；3.用毛细吸管吸取抗凝血，将4ml抗凝血沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰4.室温下立即置水平式离心机以2000rpm离心20分钟，离心后分为4层。5.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处单个核细胞（PBMC）层至一新的空离心管内。6.加入5倍以上体积的GKN液洗涤3次，每次以2000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀主要为单个核细胞），调整细胞浓度为2×106/ml。稀释的血液分离液离心稀释的血液分离液稀释的血浆单个核细胞分层液粒细胞、红细胞E玫瑰花环形成试验原理•人T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验(erythrocyte-roseetteformationtest)。•该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。实验原理T细胞SRBCSRBC受体总花环实验（Et花环）实验步骤1.取0.1ml分离好的,细胞浓度为2×106/ml的淋巴细胞，加入等量1％SRBC悬液，混匀，37℃水浴15min，500rpm离心5min，取出.2.置于4℃冰箱过夜，小心吸去上清，沿管壁加1－2滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管小心混匀。3.取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，镜下观察。实验结果计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花环，计算E花环形成率，正常值为50%-80%。E花环形成率＝形成花结的淋巴细胞数/淋巴细胞总数（形成花结+未形成花结）×100%E玫瑰花环试验总E花环实验和活跃花环•淋巴细胞与SRBC在4℃环境作用2h以上形成花环，代表外周血中T细胞总数占淋巴细胞的百分比，成为总E花环实验（Et）。如果两种细胞悬液混合后，不经37℃和4℃作用立即反应仍有部分淋巴细胞形成花环，称为活跃花环（Ea），代表对SRBC亲和力高的一个T细胞亚群。活性花环（Ea花环）实验步骤1.取0.1ml分离好的,细胞浓度为2×106/ml的淋巴细胞，加入等量0.1％SRBC悬液，混匀，室温15min，500rpm离心5min，取出.2.小心吸去上清，沿管壁加1－2滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管小心混匀，静置10-15min。3.取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，镜下观察。实验结果Ea花环的结果代表T淋巴细胞中一类亚群，计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花环，计算E花环形成率，正常值为20%-30%。E花环形成率＝形成花结的淋巴细胞数/淋巴细胞总数（形成花结+未形成花结）×100%T淋巴细胞转化试验(Tlymphocytetransformationtest)T淋巴细胞与许多特异或非特异抗原在体外共同培养时，细胞的代谢和形态可以发生一系列的变化:细胞形态向淋巴母细胞的转化。电荷的改变、细胞内蛋白质和核酸合成的增加、实验原理淋巴母细胞转化过程示意图未转化细胞过渡态细胞淋巴母细胞实验方法细胞培养:外周血分离的单个核细胞与植物血凝素(PHA)混合体外培养3天。观察细胞形态变化:部分T细胞转化为淋巴母细胞，部分可见核有丝分裂现象。判定结果0.5ml淋巴细胞加入含PHA+1640培养管CO2孵箱，培养72小时离心：1000rpm10分钟上清另置，用残液将沉淀细胞混匀配成悬液涂片，瑞氏染色，油镜观察阴性对照：不加PHA结果观察转化细胞：•淋巴母细胞：体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小。•过渡型淋巴细胞：类似母细胞。•核丝分裂相细胞：核体呈现有丝分裂，胞内可见组织染色体。未转化细胞：•成熟小淋巴细胞：体积小，核染色体致密，核/细胞比例大。衰老退化细胞：胞浆部分或全部破碎（不计数）转化率计算转化率＝转化的细胞数/淋巴细胞总计数计数200个淋巴细胞评价标准：60-80%为正常，50-59%为偏低，50%为降低。转化和未转化细胞特征细胞类别转化细胞未转化细胞母细胞过渡型细胞体积（um）≥12-2012-166-8细胞大小染色质核仁有丝分裂增大疏松1-4个+或-增大疏松有或无-不增大密集无-胞浆增色着色空泡伪足++嗜碱+或-+或-+嗜碱+或-+或--天青色--体外刺激物种类非特异抗原刺激物：如PHA、ConA等特异性抗原刺激物：如PPD细胞抗原和抗淋巴细胞抗体：如同种白细胞、抗淋巴细胞血清等淋巴细胞增殖实验（ＭＴＴ法）原理•MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。ＭＴＴ法实验步骤将培养７２小时的淋巴细胞取出，2000r/min10min，上清另置，用残液将沉淀细胞混匀配成悬液，取０.２ｍｌ细胞分别加２孔入９６孔细胞培养孔中，每孔０.１ｍｌ的细胞，每孔加MTT（5mg/ml）100ul，4-6h，加二甲基亚砜（DMSO）100ul溶解细胞中的甲瓒，37℃10-15min，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，细胞因子的测定（ＥＬＩＳＡ）•T细胞在受到非特异性有丝分裂原（PHA/CohA）刺激后，或者特异性抗原刺激被激活后，其形态和代谢产生一系列变化，会产生很多细胞因子。•培养７２小时的淋巴细胞上清液，用ＥＬＩＳＡ的方法测定上清中的IL-2的含量。具体操作方法见说明书。实验方法抽取5ml肝素抗凝血加入3mlGKN混匀2mlFicoll液表面轻轻加入4ml血水平离心2000r/min20-30min离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank“s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板，取淋巴细胞层放入无菌试管中，加4-5mlGKN洗涤，2000r/min10min弃上清，沉淀加1mlGKN溶液混匀，计数调整细胞浓度为2*106细胞/ml①②③④0.1ml淋巴细胞0.1ml淋巴细胞+0.5ml淋巴细胞+16402ml0.1ml0.1%SRBC混匀0.1ml1%SRBC混匀0.5ml淋巴细胞+PHA16402ml室温15min37℃，水浴5min500r/min5min500r/min5min37℃CO2培养箱72h，每日摇匀弃上清，沉淀摇匀4℃冰箱过夜或2h2000r/min10min加0、8%戊二醛2滴试管弃部分上清，剩余混匀摇匀,静置10-15min加0、8%戊二醛1滴，固定20-30min取上清测定因子沉淀混匀，细胞涂片，瑞吉氏染色涂片，瑞吉氏染色IL-2、TNF-a(Elisa)板0.1ml*2孔，【细胞因子测定】剩余细胞涂片镜检，计数200个淋巴镜检，计数200个淋巴瑞吉氏染色，镜检细胞中花环形成细胞细胞中花环形成细胞【Ea花环测定】【Et花环测定】【淋巴细胞转化实验（形态学检测）】每孔加MTT（5mg/ml）100ul，4-6h，加DMSO100ul，37℃10-15min酶标仪测OD值【淋巴细胞增殖实验】④双向培养组：反应管：供体细胞0.5ml+受体细胞0.5ml+16402ml对照管：供体细胞0.5ml+16402m受体细胞0.5ml+16402ml单向培养组：（设立目的在于检查培养液中有无非特异性刺激母细胞转化的物质）反应管：受体细胞0.5ml+16402ml+丝裂霉素处理的供体细胞对照管：受体细胞0.5ml+16402ml37℃CO2培养5天，每天摇匀培养瓶，结束后离心1500r/min10min，收集沉淀涂片，瑞吉氏染色，镜检，形态学观察或者MTT实验。【混合淋巴细胞培养】