食品生物技术导论 酶工程

第四章酶工程教学目标掌握酶工程的基本概念和原理；熟悉酶制剂的生产、纯化技术；掌握酶的分子修饰及酶的固定化方法；了解酶工程在食品工业中的应用。第一节酶工程发展概况1.酶的化学本质是指一类由活性细胞产生的、具有催化活性作用和高度专一性的特殊蛋白质，又称生物催化剂。不自觉的应用：传统的酿酒、制酱、制曲等。初步认识酶的存在及作用：1833年，佩恩和帕索兹发现能水解淀粉的酒精沉淀物（淀粉酶）并提出其热不稳定性；1896年，巴斯德发现酒精发酵是由酵母引起的；1897年，巴纳兄弟用酵母抽提液生产出了酒精；2.酶工程发展简史对酶的催化理论及本质的研究：1913年，米彻里斯和曼吞由中间产物学说推导出米氏方程；1926年，萨母纳从刀豆中提出脲酶，并通过大量研究证实酶的本质是蛋白质。20世纪60年代，固定化技术的发展标志着酶工程产业化形成；20世纪80年代，酶分子修饰技术发展使酶工程得到空前发展。3.酶工程的概念酶工程（enzymeengineering）又称酶技术，指利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品的过程，是酶学理论与化学工程相结合而形成的一门科学技术。第二节酶的制备与发酵生产主要途径从生物细胞内合成或直接提取分离；从微生物发酵生产获取。（一）从生物细胞获取1.植物细胞产酶P76-78：表4-12.动物细胞产酶P78-79（二）微生物发酵产酶1.常用产酶微生物细菌、放线菌、霉菌和酵母菌等（P80表4-3）。用于食品酶制剂的细胞应具备条件：安全可靠，非致病菌；稳定性好不易感染噬菌体；酶产量高，有较好的开发应用价值；容易培养和管理，产酶细胞易生长繁殖；能利用廉价的原料，发酵周期短。2.发酵方法（1）固体发酵法即以麸皮、米糠等为基本原料，加无机盐和适量水分(通常50％左右)进行的一种微生物培养法。用青霉、曲霉生产果胶酶；用木霉生产纤维素酶（2）液体发酵法利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养，是目前主要的方式。①间歇发酵法：特点：先在适于菌体生长条件下培养，然后再转入产酶条件下进行发酵。产酶量高，同时营养物质与诱导物浪费少。②连续发酵法：特点：先将菌体培养至某一生长期如对数期，然后一边连续加入新鲜培养液，另外又不断地以相同速度放出培养产物，二者的速度应和生长速度一致，使菌体生长处于恒态条件，同时还可能打破酶合成的反馈阻遏，使产酶率提高。3.微生物发酵产酶工艺条件及控制（1）培养基：碳源、氮源、无机盐、生长因子（2）温度：（3）pH：（4）溶氧量：（5）发酵时间：选育优良细胞（基因重组技术）强化生产过程：控制合理发酵条件：pH、温度、基质浓度等添加诱导物：如乳糖诱导β-半乳糖苷酶控制阻遏物浓度：产物积累一定浓度，合成受阻添加表面活性剂：主要是非离子型表面活性剂添加产酶促进剂：植酸钙镁、聚乙烯等4.提高微生物产酶量的措施（三）酶的分离纯化1.细胞分离（胞外酶）:离心或过滤2.细胞破碎（胞内酶）：许多酶存在于细胞内，提取这些胞内酶时首先需要对细胞进行破碎处理。机械破碎物理破碎化学破碎酶解破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶3.提取第三节酶的分子修饰酶分子修饰（molecularmodificationenzyme）：通过改变酶分子的结构，使酶的某些特性和功能发生改变的技术。化学修饰物理修饰（一）酶分子的化学修饰酶的化学修饰（chemicalmodification）：利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某些部分删除或置换，改变酶的理化性质，最终达到改变酶催化性质的目的。1.大分子结合修饰常用大分子修饰剂：右旋糖苷、聚乙二醇、聚蔗糖β-环糊精、琼脂糖、壳聚糖、白蛋白、明胶、淀粉、硬脂酸、聚丙氨酸等。作用：稳定性提高、抗原性降低，等等如：1分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合可使其活力提高5.1倍。2.肽链有限水解修饰指在肽链的限定肽键位点水解，使酶空间结构发生某些改变而改变酶特性和功能的方法。常用修饰剂为专一性较高的蛋白酶或肽酶。特点：既保持酶活力，又降低其抗原性。如木瓜蛋白酶水解去除其肽链上2/3氨基酸，仍可保持其活力。3.侧链基团修饰：如将α-胰凝乳蛋白酶的氨基修饰成亲水性更强的-COOH等，酶活提高1000倍，且更耐热4.分子内或分子间交联：使用双功能试剂交联，更稳定5.氨基酸置换修饰：改变活力中心的氨基酸6.金属离子置换修饰：如将酰基化氨基酸水解酶的活力中心的Zn2+置换为Co2+。（二）酶分子的物理修饰酶分子物理修饰（physicalmodificayion）：通过物理方法，不改变酶的组成单位及基团，只使酶分子的空间构象发生改变（副键变化或重排），而改变酶的某些特性和功能。高压处理：酶活提高；最适条件改变适当变性改变空间构象：稳定性适当提高第四节酶的非水相催化（自学）酶催化反应的介质有机介质反应体系酶在有机介质中的催化特性有机介质中酶催化反应的条件及其控制GoGoGoGo酶非水相催化的应用Go一、酶催化反应的介质水：酶促反应最常用的反应介质。有机介质：含有一定量水的有机溶剂气相介质：底物是气体或者能够转化为气体的物质超临界介质：超临界流体离子液介质：由有机阳离子与阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类二、有机介质反应体系1.反应体系中水对酶催化反应的影响酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、催化活性、稳定性、催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。因此，酶分子需要一层水化层（必须水），以维持其完整的空间构象。同时有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响，存在最适水含量。2.反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。根据酶分子和有机溶剂特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别。极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。因避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。有机溶剂的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。三、酶在有机介质中的催化特性热稳定性改变底物特异性产生新的酶促反应pH记忆键选择性有机介质酶催化反应的优点酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。由于有机溶剂的存在,水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程,提高收率。四、有机介质中酶催化反应及控制反应类型：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。控制：酶的种类和浓度、底物的种类和浓度、有机溶剂的种类、水含量、温度、pH、离子强度五、酶非水相催化的应用酶催化反应应用脂肪酶肽合成青霉素G前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类转酯各种酯类生产聚合二酯的选择性聚合酰基化甘醇的酰基化蛋白酶肽合成合成多肽酰基化糖类酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羟基化胆固醇氧化酶氧化胆固醇测定醇脱氢酶酯化有机硅醇的酯化第五节酶的固定化产生背景：由于酶对食品的影响广泛且成本很高，人们基于生物体内的酶固定在细胞壁和膜的现象，提出酶的固定化，希望酶能重复使用，同时又能稳定酶、改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的各种特性。酶的固定化：是指将酶与不溶性载体结合，使游离酶、细胞或细胞器等的催化活动完全或基本上限制在一定空间内的过程。固定化后的酶其仍具有酶的催化活性，能连续进行反应，并且反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶的优点易于将酶与底物及产物分离，因而产物相对容易提纯；酶能够重复利用，使用效率提高，成本低；大多数情况下可以提高酶的稳定性；可以增加产物的收率，提高产物质量；有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用。固定化酶的缺点由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶的活力难免有一定损失；而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应；不适宜于需要辅助因子的反应。（一）酶的固定化原则必须维持酶的催化活性和专一性固定化的载体必须有一定的机械强度固定化酶应有最小的空间位阻固定化酶的载体应具有最大的稳定性b.包埋法a.吸附法c.共价偶联法d.交联法（二）酶的固定化方法1.吸附法（1）物理吸附：通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用将酶固定于水不溶载体上的方法。有机载体：淀粉、谷蛋白、纤维、甲壳素等。如木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。无机载体：活性炭、多孔玻璃、多孔陶瓷、氧化铝、硅胶等；如：用多孔硅为载体吸附米曲霉和枯草杆菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃进行固定化。代表性酶：α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶特点：吸附容量较低(一般小于1mg蛋白/g吸附剂)；酶活力损失少；与载体结合力较弱，容易脱落。（2）离子吸附将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法（酶吸附较牢固）。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、DEAE-Sephadex葡聚糖凝胶；阳离子交换剂，如羧甲基(CMC)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等。代表性酶：葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀．用0.5mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.0~7.5的米曲霉3042粗酶液，充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。此外，DEAE-纤维素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。优点：操作简单，处理条件温和，可以得到较多高活性的固定化酶；可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时载体可以回收再利用。缺点：吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和操作的稳定性。2.包埋法指用一定方法将酶包埋于半透性的载体中，制成固定化酶的方法。（1）凝胶包埋法：指将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中制成的固定化酶或固定化菌体。常见凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。特点：条件温和，对酶活影响小，但强度差（2）半透膜包埋法又称微胶囊包埋法，