抗球虫抗球虫药药耐药性与新开发应用

抗球虫药耐药性与新抗球虫药开发应用乔彦良（博士/技术总监）山东信得科技股份有限公司鸡球虫病由艾美耳属（Eimeria）的多种单细胞寄生虫引起的严重危害鸡生长发育的一种疾病，发病率50～70%，死亡率20～30%，严重时高达80%。在各种鸡病中，球虫病发生率最高，占1/6～1/5，全世界每年因球虫病造成的经济损失多达20亿美元，抗球虫药的年消费为3.2亿美元。抗球虫药对于减轻鸡球虫病的危害起到了极大的作用，但球虫几乎对所有使用过的抗球虫药物都有耐药虫株出现。球虫耐药性的产生，导致抗球虫药使用年限缩短，防治失败或效果不佳，引起临床或亚临床鸡球虫病，造成很大的经济损失。鸡球虫耐药性1939年之前，尚无治疗球虫病的有效药物，不存在耐药性问题1939年Levine发现磺胺类药物对鸡球虫病有效以来，化学疗法才成为防治球虫病的主要手段。由于当时未意识到耐药虫株的出现，故曾认为球虫与细菌不同，是不易产生耐药性的生物。1945年在美国从野外分离出怀疑有耐药性的虫株。1954年又从野外分离出对包括磺胺类在内的数种药物有明显耐药性的虫株。60年代，对多种药物有耐药性的虫株开始出现，即使对新药，在1～2年内就可获得耐药性。70年代开始，新药的开发速度已开始赶不上耐药虫株出现的速度。1963年，世界卫生组织的专门委员会定义耐药性为:寄生虫虫株在使用使同种寄生虫杀灭或抑制其繁殖的药物浓度下仍有繁殖的能力。抗球虫药分类1干扰虫体生物膜离子转运的药物离子载体类抗生素是目前应用最广泛的抗球虫药，如莫能菌素、盐霉素、拉沙里菌素、马杜拉霉素、海南霉素等。离子载体类抗生素能穿过细胞膜，影响离子转运。这些药物在子孢子或裂殖子等穿入宿主细胞之前被吸收，可与Na+，K+，Ca2+，Mg2+等在虫体内起重要作用的阳离子结合形成脂溶性络合物，协助阳离子进入虫体内，导致生物膜两边的Na+、K+、Ca2+、Mg2+等阳离子梯度变化，破坏细胞内外的正常离子平衡，使细胞内外形成渗透压差，大量水分进入，使虫体细胞破裂死亡。抗球虫药分类2.影响辅酶吸收和合成的药物磺胺类是第一个被广泛用于防治球虫病的药物。磺胺类通过阻断叶酸合成途径阻止球虫的正常发育。磺胺类药物的基本化学结构与对氨基苯甲酸相似，可与氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，同时还可抑制二氢叶酸合成酶的活性，妨碍二氢叶酸的合成，最终影响核蛋白的合成，从而抑制了球虫细胞的生长发育。具有相似机制的药物还有:乙氧酰胺苯甲酯，乙胺嘧啶，二甲氧甲基苄胺嘧啶（OMP），三甲氧苄胺嘧啶（TMP）等。氨丙啉的化学结构与硫胺素（VB1）相似，是硫胺的拮抗剂，其抗球虫作用可能是竞争性的抑制虫体硫胺摄取而导致硫胺缺乏，妨碍虫体内的糖代谢过程，从而抑制了球虫的发育。双间硝苯二硫（Ni-trophenide）主要抑制甘露醇-1-磷酸脱氢酶的活性，妨碍甘露醇循环，从而阻断卵囊孢子化过程中的能量来源而起到抑制球虫的作用。抗球虫药分类3抑制虫体线粒体功能的药物喹诺啉类通过阻断虫体线粒体的电子转运，抑制柔嫩艾美耳球虫的呼吸作用，使球虫不能正常发育。实验表明，喹诺啉类在电子转动链中的作用位点位于辅酶Q与细胞色素b之间。氯羟吡啶也影响球虫电子转运过程，但与喹诺啉类的作用机制不同，这可能是作用位点不同所致。球虫线粒体的电子转运存在两种不同终端氧化酶的生化途径，一条途径对低浓度的癸氧喹酯敏感，其可能存在一对癸氧喹酯具有高亲和力的位点；另一条生化途径终止于细胞色素氧化酶，氯羟吡啶可能作用于这条生化途径。抗球虫药分类4、作用于虫体类质体的药物地克珠利和妥曲珠利可在不对宿主细胞产生影响的药物浓度下，使虫体内质网扩张并空泡化，它们还可抑制球虫磷酸合成中心PSⅡ的重要组成成分D1蛋白质的功能。D1蛋白质与低氧状态的电子传递有关，有可能提供虫体氧自由基，使其更容易侵入宿主细胞。抗球虫药分类5、抑制核酸合成的药物核苷类似物，如氟腺嘌呤等嘌呤类抗球虫药，主要影响虫体对嘌呤核嘧啶的利用，最终使核酸合成减少，使虫体的生长繁殖受阻。磺胺类药物可通过抑制嘌呤和嘧啶的合成，使核酸合成障碍而发挥抗球虫作用。耐药性产生的机制——细胞、亚细胞水平球虫受到抗球虫药的作用，其内部结构发生一系列变化，线粒体发生膜性漩涡或形成髓鞘样结构，内质网、高尔基体含水量增加，细胞膜及核膜模糊或破损。而在同样的药物浓度下，耐药虫株因虫细胞膜和细胞器已发生结构或功能的改变，能够全部或部分抵御药物对其造成的损伤，不能造成死亡而生存下来。耐药性产生的机制——代谢水平在药物长期作用下，球虫改变了代谢途径，用其它的代谢方式代替原来的代谢方式，避开了抗球虫药的作用位点;球虫通过代谢变化，降解或破坏药物的分子结构或功能基团，从而使药物失去作用;球虫通过代谢途径变化对其本身进行修饰加工，并且调动自我防御机制，延缓或抑制药物侵入其内部，从而使药物失去其应有的活性。耐药性产生的机制——分子水平细胞的遗传物质是DNA，DNA复制时，由于某种原因造成个别碱基配对不准，发生基因突变，导致遗传信息的微弱改变。当突变发生在处于新的不利于生物生存或繁殖的环境中时，就有助于生物体对新环境的适应球虫在抗球虫药物存在条件下，有些突变个体反而对球虫生存和繁殖有利，而没有突变的个体则会被抑制或杀灭，经过多次这样的过程，就产生了对球虫药的耐药性。耐药性的特点——耐受高浓度抗球虫药对绝大多数抗球虫药来说，在防治鸡球虫病时，球虫一旦对某种药物产生了耐药性，它便可耐受其连续使用浓度的4～8倍，甚至更高的浓度；此时再提高药物浓度，它又可耐受此浓度的4～8倍甚至更高的浓度，而实际生产上这一浓度足以对鸡群本身造成毒害作用。喹啉类药物曾为防治鸡球虫病的优良药物，任何一种喹啉类化合物以40mg/kg剂量连续使用，可完全抑制球虫的增殖，然而获得耐药性后，即使是用1000mg/kg以上的剂量也完全无效。甘德培等在获得了对氯嗪苯乙氰的有效浓度（0.125mg/kg）的耐药虫株后，很容易就诱导了高出该浓度10倍量浓度的抗药虫株。耐药性的特点——具有多重耐药性鸡球虫具有对两种或两种以上化学性质各异、作用方式不同的抗球虫药同时或先后产生耐药性的能力。这种多重耐药性不仅可在实验室通过耐不同单一药物的虫株之间进行杂交获得，而且从田间分离的虫株也同时具有对2～4种药物的耐受性，报道过对氨丙啉，氯羟吡啶，癸氧喹酯，尼卡巴嗪耐受的虫株。报道过一株柔嫩艾美耳球虫对氨丙啉轻度抗药，对氯羟吡啶中度抗药，对马杜拉霉素和氯苯胍中度或完全抗药;在河北秦皇岛地区分离的6种艾美耳球虫对马杜拉霉素和盐霉素轻度抗药，对拉沙里菌素和氨丙啉中度抗药，对球痢灵和常山酮重度抗药。耐药性的特点——具有交叉耐药性鸡球虫的交叉耐药性主要表现在，当球虫对某种抗球虫药物产生耐药性的同时，也会对从来未接触过的同类药物产生耐药性，这种耐药性往往出现于化学结构相似、作用机理相近的药物之间。报道过对单价离子载体抗球虫药失去敏感性的虫株，对除马杜拉霉素外的其他单价离子载体类抗球虫药也耐受，而对二价的拉沙里菌素敏感。证实作用机理不同的化学药物地克珠利和妥曲珠利之间无交叉耐药性。耐药性的特点——具有遗传性和相对稳定性耐药性的产生是球虫群体中突变个体多次重复选择的结果，球虫在其生活周期的后期进行有性生殖，形成卵囊，耐药性也世代相传。耐药性的检测方法1鸡体实验法将供试药物按一定的比例与饲料均匀混合后饲喂幼雏，经过一定时间后接种球虫，通过某些指标或标准来判断球虫的耐药性。目前采用的判定标准有卵囊产量，病变计分，相对增重率，最适抗球虫活性百分率，粪便计分，抗球虫指数等。。2同工酶分析测定法利用测定耐药虫株与敏感虫株同工酶谱间的差异或测定耐药虫株与标准耐药虫株同工酶谱的相似性来进行判定。这种方法首先是确定某种药物耐药虫株的特异性同工酶谱，再将现场测定的虫株的同工酶谱与之比较，根据其差异是否显著来判定球虫对药物敏感与否。3超微结构比较法产生耐药性的虫株，能成功躲避药物的作用，其超微结构会产生相应的变化，以避开药物作用的位点。在电镜下观察柔嫩艾美耳球虫对马杜拉霉素的敏感株与耐药株的超微结构发现敏感株在药物作用下132棒状体消失，微线体的数量减少或消失，耐药株无异常反应。对莫能菌素产生耐药性的柔嫩艾美耳球虫的子孢子可表达分子量分别为50KDa和31.4KDa两种蛋白质，而对莫能菌素敏感的柔嫩艾美耳球虫的子孢子不表达这两种蛋白质。耐药性的检测方法耐药性的检测方法4RAPD测定法以PCR为基础的基因分析方法，称之为随机扩增多态性DNA（RAPD）该方法用单一或多个随机核苷酸序列作为引物，对基因组DNA进行扩增，避免了PCR特异性引物设计上的困难，尤其在对未知样本的鉴定方面，显示了其独特的特点，作为一项新的技术和工具，可用于球虫种的分子诊断，基因图谱以及遗传多样性等的研究。5细胞和鸡胚培养法鸡球虫的体外细胞培养和鸡胚培养技术用于球虫耐药性的研究。利用细胞模型和鸡胚模型测定药物对球虫的最小抑制浓度（MIC）和药物对鸡胚的最小毒性浓度（MTC）以观察球虫的抗药性，从而筛选药物。耐药性的获得对具有预防或治疗效果的药物，采用一定方法，经过传代球虫，实验性地使球虫获得耐药性，根据耐药性产生的时间和强度等，预测该药物在野外有效使用的期限，这种方法称为耐药性的获得。耐药性的获得方法一种是Weppelman法:在推荐使用药物浓度下大剂量感染球虫卵囊的方法;一种是药物浓度递增法:以低于使用推荐剂量的药物浓度开始诱导，逐步提高浓度，多次继代后获得抗药性虫株。耐药性获得的应用尽管目前在实验室条件下获得抗药性虫株与现场实际中抗药性虫株的产生存在差异，但二者之间有一定的关系，且目前仍未有标准的实验方法用于预测新型抗球虫药抗药性虫株出现的速度。可通过实验室中某药物耐药性的获得，来判断该药物的耐药性产生的可能性及其在生产中多久会产生耐药性。可用于耐药性产生机制的研究。为进一步在分子水平研究球虫耐药性提供材料，以便建立耐药虫株的基因图谱和特异性同工酶谱。作为药物交叉耐药性的检测手段之一：要证明两药物之间是否存在交叉耐药性的最好办法是分离一种艾美耳球虫虫株，鉴定它对两种受试药物均表现敏感，然后在严密条件下诱导，使它对其中一种药物产生耐药性，再检测获得耐药性的株对另一种药物是否也同时产生了耐药性，如果也产生了耐药性则说明对两药具有交叉耐药性。药物敏感性的恢复就某一耐药性虫株而言，其耐药性是相对稳定的，但对球虫群而言，其对某一药物的敏感性是可以恢复的。在一个球虫群中，在5年或更长时间内不接触有关药物的情况下，耐药性是可以消失的。在耐药性虫株中引入大量的药物敏感株，在没有药物作用下，耐药性可以消除。原因是不用药的情况下，敏感株占优势地位。耐药性的延缓或解决措施合理用药：到目前为止，用于抗球虫的药物多达50余种，根据各药特点以及田间耐药性产生情况，合理应用这些抗球虫药物，可延缓耐药性的产生，延长药物的使用年限。联合用药：在同一个饲养期内并用两种或两种以上抗球虫药，通过药物间的协同作用，即可延缓耐药虫株产生，增强药效，又可扩大抗球虫谱。克球粉+莫能菌素，地克珠利+氨丙啉，氯苯胍+呋喃唑酮联合使用，其效果强于每药单独使用。穿梭用药：在同一饲养期内，换用两种或三种性质不同的抗球虫药。具体实施时，要在球虫病高发阶段使用高效抗球虫药，低发阶段使用低效抗球虫药。为了避免虫株对所用的药物同时产生耐药性，鸡场应有计划地更换穿梭用药方案。轮换用药：季节性地或定期变换用药，每隔3个月或半年改换一种抗球虫药，目的是避免耐药性虫株出现。但不要改用作用机理和作用峰期相同的药物，以免产生交叉耐药性或变换用药后效果不明显。耐药性的延缓或解决措施2新药研制随着生物化学，细胞生物学和分子生物学等技术的发展，对药物和球虫的研究取得较大的进展。药物作用机制和球虫耐药机制的阐明，为新药的开发提供了思路。Allcocco等研究了双间硝基苯二硫（Nitrophenide）的作用机制，指出可研制新药作用于球虫的甘露醇循环