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抗生素药物的分析方法研究进展学生:张丽娜指导教师:魏琴吴丹李冬梅夏方诠摘要综述抗生素药物的种类,对各种抗生素药物的应用和副作用进行简要介绍。全面介绍抗生素药物的分析测定方法,尤其对测定头孢类抗生素的测定方法进行综合性全面阐述。关键词抗生素;分析进展引言抗生素是某些微生物的代谢产物,对各种病原微生物有强力的抑制或杀灭作用,是临床医学上的一类重要药物。近年来,世界上抗生素的生产和应用都得到了很大的发展,为保障人类的健康发挥了重要作用。抗生素种类繁多,目前,世界各国实际生产并用于医疗的抗生素有三百余种[1]。根据不同的研究目的,有不同的分类方法,如以化学结构和性质而言,可分为以下9类[2]:1.β一内酰胺类;2.氨基糖苷类;3.大环内酯类;4.氯霉素类;5.四环素类;6.多肽类;7.抗肿瘤类;8.林可霉素类;9.其他。为了有效地使用抗生素类药物和进一步研究开发新药,一方面必须控制和保证药物及制剂的质量,即必须进行成品药物分析;另一方面还要加强对药物在肌体内的作用机理和规律的研究,即需要进行体内药物分析,这些都对分化学提出了新的、更高的要求。因此,除了对现有方法进一步改进和完善外,研究和发展新的高灵敏、高选择性分析技术,以便更好地满足药物生产和临床分析的需要,无疑是一件重要意义的工作。1抗生素药物的作用与分析1.1氨基糖苷类氨基糖苷类抗生素,如链霉素、庆大霉素、新霉素、双氢链霉素等,对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果,可以有效抑制细菌的生长和繁殖,因此是目前我国农业、畜牧业和水产业中常用的兽药之一,如用于防治鱼病、治疗细菌性烂鳃病、赤皮病、肠炎病、白头白嘴病等,也常添加到饲料中促进生长发育[3-4]。该类抗生素的主要毒副作用体现为对于脑神经、听觉以及肾脏的损害。因此,针对该类药物在食品中的残留,许多国家和机构都规定了明确的最大残留限量(MRLs)。例如,瑞士规定,肝脏中链霉素的MRLs为0.5mg·kg-1,肾脏中的MRLs为1.0mg·kg-1;欧盟2377/90/EEC规定,肝脏中的最大残留量为2.0mg·kg-1,肾脏中的最大残留量为5.0mg·kg-1,肌肉中链霉素的最大残留量为0.3mg·kg-1[5]。1.2大环内酯类该类抗生素(Marcrolides)是一个以15~17个碳组成的大环内酯为母体,通过羟基,以苷键和1~3个分子的糖相连接的一类抗菌药物,包括红霉素、泰乐菌素、螺旋霉素、罗红霉素、麦迪霉素等[6]。它们是一类抗菌谱广、能耐碱、半衰期长、生物利用度高的药物,作用机理是与霉形体核蛋白50S亚基结合,抑制蛋白质合成,导致其死亡[6]。阿齐霉素与红霉素相比,对革兰阴性菌如流感杆菌的抗菌作用增强。阿齐霉素具有明显的体外抗菌作用和体内抗菌作用[7]。1.3氯霉素类氯霉素(Chloramphenicols,简称CAPs)包括氯霉素及其衍生物,又称为酰胺醇类(Amphemicols)。主要有氯霉素、琥珀氯霉素、棕榈氯霉素、甲砜霉素(Thiamphnicol,TAP)、氟甲霉素和乙酰氯霉素[8]。氯霉素是一种广谱抗生素,能抑制细菌蛋白质的合成,但对革兰氏阴性菌较强。对各种立克氏体、原虫及部分病毒也有一定的抑制作用。目前,氯霉素类药物在水产养殖和畜禽养殖中应用广泛。氯霉素存在严重的毒副作用,能抑制人体骨髓造血功能,引起人类的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿、早产儿灰色综合症等疾病,低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性,因此动物食品中的氯霉素残留对人类的健康构成了巨大威胁[9]。氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”[10],即不得检出。我国是一个动物性制品大国。近年来,我国出口的动物性食品频频被进口国检出氯霉素残留。针对这种情况,农业部已将氯霉素从2000年《中国兽药典》中删除,此药重新进入安全评价体系,在《动物性食品兽药残留规定》中规定可食部分不得检出,并且在出口的日常检测中,将其列为必检项目,一旦发现超标,一律禁止出口。因此,对氯霉素的检测是十分必要的。1.4四环素类四环素(Tetracycline,TC)分子式为C22H26N2O7,分子量430.45,具有十二氢化并四苯基本结构,属于四环素类的一种广谱抗菌药物[11]。临床上主要用于治疗革兰氏阳性和阴性菌、支原体、衣原体、立克次体和螺旋体等致病原引起的感染[12]。近年来用四环素治疗不少非感染性疾病,取得了很好的疗效[13]。此外,在包括美国在内的一些国家和地区,四环素还被大量用作生长促进剂投喂给动物,故其在药品市场中占有重要地位。四环素类药物作为一类广谱抗生素,它主要包括天然四环素(四环素、土霉素、金霉素、去甲金霉素等)和半合成四环素(甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺四环素等),曾以价格低、抗菌谱广、饲料报酬高等优点而在养殖业上被广泛地应用[14]。长期摄入四环素残留超标的食品,可使机体内感染的病原菌和寄生菌受到抑制,不敏感或耐药菌得以滋生,非敏感菌大量生长,造成菌群失调而引起二重感染[15]。1.5头孢菌素类头孢菌素类抗生素的临床使用量近年来始终占抗生素类药物的首位[2]。测定该类药物在药物制剂及体液中的含量对指导临床用药及药物在体内的药代动力学分析都具有极其重要的意义。检测方法主要有生物学方法和化学方法。1.6多肽抗生素通常是指具有某种抗菌活性的多肽类物质。它们具有水溶性好,热稳定性强,免疫原性低,抗菌谱广的特点[16]。最初,人们把这类具有抗菌活性的多肽称为“antibacterialpeptides”,中文译为“抗菌肽”,其原意应为“抗细菌肽”。后来发现有些“抗细菌肽”还有抗真菌等其他微生物的功能,便称之为“antimicrobialpeptides”。但是随着研究的深入,人们相继发现这类多肽还具有抗寄生虫、病毒、癌细胞等功能,尤其是随着这类多肽物质在医药学上的应用,许多学者倾向于称之为“peptideantibiotics”即“多肽抗生素”。迄今为止,已在昆虫、鸟类、动物及植物等生物中发现了700多种内源多肽抗生素,部分收录在意大利Trieste大学的多肽抗生素数据库中。其中,对植物多肽抗生素的研究近年来十分活跃,在分离纯化、抗菌特性、细胞毒性、理化性质以及转基因等许多方面的研究进展很快。1.7蒽环类pH条件下为极性较强的碱性化合物,因此一般用强离子交换柱进行分离,这样可以进一步提高检测的精确度、稳定性和重复性。由于氨基糖苷类抗生素没有特征的紫外吸收,可以利用其结构中的活泼基团(如氨基、羰基)与衍生化试剂形成紫外区有吸收或有荧光的物质,以便于紫外检测或荧光检测,其中又可分为柱前衍生和柱后衍生2种衍生化方法。柱前衍生反相HPLC是测定此类药物最为常用的一种方法。常用的柱前衍生化试剂有邻苯二甲醛(OPA)、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、3,5-二硝基苯甲酰氯(DNBCL)(以上用紫外检测器)以及氯甲酸芴甲酯(FMOC-CL)(用荧光检测器)。柱前衍生化方法的特点是较蒽环类抗肿瘤抗生素是一类非常有效且常用的抗肿瘤药物。应用转铁蛋白受体单抗(TFR-M)为载体的免疫导向化疗能把化学抗肿瘤药物专一地导人体内残留的肿瘤细胞处,提高了肿瘤灶局部的化疗药物浓度,是一种疗效好、毒性低的抗肿瘤疗法;将脂质体技术应用于肿瘤化疗能减小毒性、延长寿命,多柔比星隐形脂质体给药组的肿瘤抑制率比普通脂质体高。近年开发的新的蒽环类抗肿瘤药物:4-脱甲氧基-3-脱氨基-3-吖丙啶基-甲磺酰基-柔红霉素、3-去氨基-3-吗啉代-3去氧代-l0-羟基-盐酸洋红霉素(MX2)、1,4-蒽醌、甲氧基吗啉代多柔比星、3-脱氨基-3-羟基-4-(O-L-daunosaminyl)-4-脱甲氧柔红霉素(MENLO755)。1.8林可霉素类林可霉素(lincomycin)是一种高效广谱抗生素。于1962年由美国人Mason等首先从链霉菌林可变种培养液中获得,从此获得广泛应用。林可霉素的分子式为C18H34N2O6S,分子量为406.56。林可霉素对革兰氏阳性菌有较强的抑菌作用,特别是对链球菌、金黄色葡萄球菌及厌氧菌的抗菌作用尤其明显,在许多感染症的治疗中疗效显著[17]。林可霉素(简称A)由反-4’-正丙基古液酸与甲基α-硫林可霉糖经酰胺键结合而成。在其发酵过程中同时伴生少量的林可霉素B(简称B)以及痕量的差向林可霉素(简称E)。而A与E的区别则只在于林可霉糖结构式的7位上,A为R构型羟基;E为S构型羟基。2药物分析的研究方法2.1高效液相色谱法2.1.1高效液相色谱法的研究现状高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品,由流动相带入柱内,在柱内各成分被分离后,依次进入检测器,色谱信号由记录仪或积分仪记录的一种分析方法。2.1.2高效液相色谱(HPLC)在药物分析中的应用高效液相色谱法分离效能高,应用范围广,不仅可以分离,而且可以准确地测定各组分的峰面积和峰高,在杂质检查中的应用日益增多;是近年来发展较快的方法,它能较好地分离供试药品中可能存在的降解产物、未除尽的原料及中间体等杂质而准确定量[18-25]。现就部分头孢菌素类抗生素高效液相测定见表1:表1高效液相色谱法测定部分头孢菌类抗生素被测物样品类型色谱柱流动相检测波长(nm)头孢唑啉血浆SpherisorbC18柱甲醇-0.1磷酸二氢钾275头孢噻肟纳药物制剂μBondapakC18柱磷酸二氢酸-甲醇236头孢羟氨苄血浆HversilODS柱0.01MNaH2PO4-乙腈(96:4)230头孢泊肟脂原料Shim-Pack苯基柱0.005MKH2PO4-甲醇-乙腈260头孢呋辛血清YWG-C18H37\不锈钢柱甲醇-水-冰醋酸(28:71:1)290头孢美唑胆汁C18柱缓冲液(pH=7.0)-乙腈(80:20)272头孢克罗血清Shim-PackCLC-ODS柱磷酸盐缓冲液-乙腈(87.5:12.5)254头孢曲松血清尿液DiscoveryC18柱KH2PO4-CH3CN(1:1)274头孢他啶肾脏透析液μBondapakC18柱甲醇-醋酸胺(17:83)254头孢氨苄药物制剂C18柱甲醇-磷酸盐缓冲液254头孢克洛药物制剂KromasilC18柱KH2PO4甲醇-乙腈-s乙腈-水265检测氨基糖苷类抗生素大多采用反相色谱或离子对色谱系统。氨基糖苷类抗生素在低简单,不需要特殊的设备。柱后衍生化则采用在线技术,可便于自动化测定,但需要有特殊的衍生化反应装置,因此柱前衍生化方法目前较多被采用。链霉素是研究较多的一种代表性氨基糖苷类抗生素,目前也主要采用液相色谱法进行检测,尤其是柱后衍生-高效液相色谱法。1994年GERHA等[26]采用阳离子固相萃取柱净化样品,柱后衍生液相色谱荧光检测法,测定了动物组织中链霉素和二氢链霉素残留。姜莉和赵守成[27]用柱后衍生-荧光检测快速测定鲜牛奶中链霉素残留量,回收率达到78.3%~80.2%。陈晓红等[28]采用双试剂柱后衍生法,在C18柱上以0.01mol·L-11-庚烷磺酸钠+已腈(65+35)为流动相,以荧光检测器检测蜂蜜中链霉素的残留量,并选用三氯乙酸溶液(1+1)作为沉淀剂,建立了一种较好的链霉素检测方法。四环素残留分析,国内外文献报导的研究内容大多数为水产品、蜂蜜、牛奶、肉与肉制品等动物源性食品,并且多数为检测方法的研究。黄志勇[29]等用HPLC检测水产品中的四环素残留,用4%的HClO4处理样品,经浓缩,用乙腈和0.01mol·L-1的磷酸二氢钠做流动相,在50~1000μg·ml-1范围内,峰面积与四环素浓度呈良好的线性关系(r0.99),以测量的3倍标准偏差计算方法的检出限分别为0.041μg·g-1。杨挺[30]等建立了一种高效液相色谱法测定水产品中土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、脱氧土霉素的分析方法。样品用5.0%高氯酸溶液提取,上清液用Oasis
本文标题:抗生素药物的分析方法研究进展
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