拉米夫啶耐药及实验室检测

慢性乙肝诊断与治疗中的分子指标杨志军乙型肝炎病毒感染的现状全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程慢性乙肝的诊断HBsAg持续阳性6个月以上HBV-DNA高于105拷贝/毫升ALT持续升高或反复升高慢性乙肝的分类HBeAg阳性乙肝：HBsAg、HBeAg阳性；HBV-DNA高于105拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高HBeAg阴性乙肝：HBsAg、anti-HBe阳性；HBV-DNA高于104拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高诊断慢性乙肝的指标生化指标：ALT免疫学指标：HBsAg（携带指标）、HBeAg（活动指标）病毒学指标：HBV-DNAHBeAg阴性乙肝缺乏病毒活动的免疫学指标，前S1可以弥补这一缺憾，提供HBeAg阴性乙肝患者病毒活动的免疫学指标HBV-DNA检测的基本要求虽然国内HBV-DNA检测都用实时荧光PCR法，但不同厂家的产品定量标准的赋值有差异，从而导致定量结果的差异，而准确的定量结果直接影响到对病人的诊断以及治疗方案的选择复星HBV-DNA试剂是国内唯一一个经过标准品溯源的产品，标准品直接用国家标准定标，从而保证定量结果的准确可靠，能够为慢性乙肝患者的诊断和治疗提供更为客观的依据慢性乙肝治疗的长期目标防止发展成为肝硬化或肝细胞癌在临床上，往往以比较现实的短期目标来代替长期目标慢性乙肝治疗的短期目标病毒抑制：表现为HBeAg血清转换和HBV-DNA阴转肝损伤程度降低：表现为转氨酶恢复正常完全清除病毒：表现为HBsAg消失，HBsAb出现，血清和肝细胞中检测不到HBV-DNA从目前水平来看，不可能完全清除病毒治疗慢性乙肝的药物免疫调节剂：干扰素、PEG干扰素、胸腺肽核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等拉米夫定治疗与转氨酶浓度拉米夫定治疗一年后的HBeAg阴转率和HBV-DNA阴转率：ALT浓度低于2倍正常值高限：5%ALT浓度介于2-5倍正常值高限：26%ALT浓度高于5倍正常值高限：64%HBV-DNA定量检测的临床应用慢性乙肝诊断治疗监测和疗效评价跟踪随访预后判断HBV-DNA定量—慢性乙肝的诊断HBsAg阳性六个月以上ALT持续升高或反复升高HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）HBV-DNA定量—抗病毒治疗的条件ALT高于2×ULN（正常值上限）HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）ATL持续正常的患者可暂不进行治疗，每隔3-6个月随访肝功能、血清病毒学标志物和进行肝细胞肝癌监测ALT水平在1-2倍ULN之间，需根据具体情况(如肝活检结果等)，在告知患者治疗的利与弊、了解患者配合程度的前提下，决定是否实施治疗。无论治疗与否均应密切随访，为治疗提供更为科学的根据HBV-DNA定量—慢性乙肝的治疗监测治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA）治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效HBV-DNA定量—疗效评价（1）生化学应答：完全应答：2次监测ALT均复常(间隔1个月)；无应答：ALT未恢复正常。值得注意的是评价生化学应答时应排除其他药物或疾病对ALT升高或下降的影响HBV-DNA定量—疗效评价（2）病毒学应答：完全应答按所采用的HBVDNA检测方法说明书上提供的实验敏感性和检测范围确定，临床上一般认为采用国际公认的检测方法或敏感性相当的检测方法检测HBVDNA定量105拷贝/毫升或斑点杂交法阴性为完全应答；部分应答为未达完全应答标准但HBVDNA载量下降大于2个对数级；无应答为未达上述标准HBV-DNA定量—疗效评价（3）血清免疫学应答：完全应答为HBeAg/抗HBe血清转换；部分应答为HBeAg阴转但未出现抗HBe；无应答为未达上述标准。HBV-DNA定量—综合疗效评价（1）完全应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学所有指标均达到完全应答HBV-DNA定量—综合疗效评价（2）部分应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学指标介于完全应答和无应答之间HBV-DNA定量—综合疗效评价（3）无应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学指标均为无应答HBeAg阴性伴HBVDNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者不进行血清免疫学应答评价，但应进行生化学和病毒学指标的疗效评价HBV-DNA定量—何时可以停药（1）治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时综合疗效达到完全应答者建议至少继续用药6个月，期间每3个月1次复查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答者可停药观察HBV-DNA定量—何时可以停药（2）治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时综合疗效达到部分应答者建议继续用药直至达到完全应答后，再继续用药至少6个月，期间每3个月1次复查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答者可停药观察HBV-DNA定量—何时可以停药（3）治疗前HBeAg阳性患者治疗1年时综合疗效仍无应答可停药观察，或改用其他有效的抗病毒药治疗。对于有肝脏组织学检查等其它临床指征显示病情进展合并肝功能失代偿或肝硬化的病人，不宜轻易停药，并应加强对症保肝治疗HBV-DNA定量—何时可以停药（4）HBeAg阴性伴HBVDNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者，综合疗效完全应答者疗程至少2年；对于完成1年治疗仍无应答者可改用或加用其他有效治疗方案HBV-DNA定量—治疗后的随访无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每3～6个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBVDNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。HBV拉米夫定耐药虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67%一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹YMDD变异检测采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义能够准确稳定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案HBV拉米夫定耐药突变检测试剂原理PrimerFPrimerFPrimerFProbeProbeProbePrimerHBVPrimerYIDDPrimerYVDDHBV检测I突变检测V突变检测YMDD的定量检测采用选择性引物，基于TaqMan实时PCR技术，在三个平行反应中分别扩增总HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（V管），根据管间Ct值差异计算突变毒株在病毒群体中的比例YMDD的定量检测YMDD的定量检测YMDD的定量检测YMDD的定量检测YMDD的定量检测与其它方法的比较Comparisonofresultsobtainedbysequencing,pyrosequencingandreal-timePCRTypesSequencingpyrosequencingreal-timePCRrtM20425(36%)24(35%)23(33%)rtM204I26(38%)24(35%)21(30%)rtM204V18(26%)19(27%)20(29%)rtM204I+rtM204V02(3%)5(8%)YMDD变异定性判断的临界值定性判断：ΔCt3.5，此时病毒群体中突变株比例大于10%与测序法比较，15例标本结果完全符合YMDD变异定性判断的临界值Wangetal,WJG,12:1308-1311什么时候开始检测YMDD变异拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况治疗时间HBVDNA大于104copies/ml例数YMDD变异例数*6个月61（17%）6~12个月2614（54%）12~24个月3826（68%）24~36个月3838（100%）*各组之间两两比较均有显著差异（P0.05）。YMDD变异株的动态变化YMDD变异株的动态变化YMDD检测试剂—应用方法对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测治疗前检测一次（约有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异）治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次慢性乙肝的基因分型乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列的差异可以分为A～H八种亚型，我国以B型（41%）和C型（53%）为主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化不同的基因型对药物的应答也不一样：基因型B比基因型C对干扰素治疗的应答率高HBV基因分型PCR检测试剂运用多重、多色实时PCR技术，分别对乙肝病毒（HBV）各种基因型序列进行分析根据国内HBV基因型的特点，设计能检测HBVA~D四种基因型特异性引物及探针研制开发具有自主知识产权的乙肝病毒（HBV）基因分型多重、多色实时PCR检测试剂盒HBV基因分型—结果判断方法B管（Ct36）B管（Ct≥36）C管（Ct36）B型、C型HBV复合感染2C型HBVC管（Ct≥36）B型HBV非B非C型，或HBV（-）HBV基因分型—分型识别率分型识别率＝（12+22）/35＝97％样本数百分比B型1234%C型2263%未检出13%总计35100%HBV基因分型—分型灵敏度（1）HBVB型血清样本灵敏度约在2×103IU/mlHBV基因分型—分型灵敏度（2）HBVC型血清样本灵敏度约在1×103IU/ml共价闭合环状DNA(cccDNA)检测HBVcccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板只有彻底清除了cccDNA，乙肝的治疗才能算真正有效HBVcccDNA可作为评价抗病毒治疗效果新的有效指标HBVcccDNAPCR检测试剂运用实时PCR技术，根据乙肝病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）和双链松弛环状DNA（rcDNA）分子结构上的差异，即rcDNA负链上的缺口和正链的不完整性，设计一对特异性cccDNA的引物，分别杂交于1500和2100邻近区域(以EcoRI切点为物理起始原点)，同时设计一条杂交于负链3’端近缺口处检测探针，研制开发具有自主知识产权的HBVcccDNA实时PCR检测试剂盒。HBVcccDNA检测试剂原理rcDNA不能被扩增无荧光信号cccDNA能被扩增检测到荧光信号P118201590+3200（1）EcoRIP2－EcoRI5‘+P23200(1)5‘3‘15903‘1820－P1阿德福韦治疗乙型肝炎阿德福韦为5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明显抑制HBVDNA复制HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1%HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0%、3.0%、5.9%~11%阿德福韦耐药突变位点rtN236T、rtA181V恩替卡韦治疗乙型肝炎拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低8至30倍；发生YMDD变异患者治疗1年时对恩替卡韦耐药发生率为5.8%，并出现相关的位点变异。恩替卡韦耐药突变位点如果乙肝病毒多聚酶存在rtL180M和/或rtM204V/I，rtT184，rtS202和/或rtM250等位点变异将造成对恩替卡韦耐药1896突变的诊疗意义G1896A点突变，形成终止密码子(TAG)，不表达HBeAg；由于e抗原不能合成，血清中检测不到HBeAg，但乙肝病毒仍处于复制状态；此类HBeAg阴性乙肝患者更容易发生严重的肝脏疾病，需接受更为长期的抗病毒治疗。基因检测在乙肝诊疗各阶段的应用药物治疗方案的