拟衰老耳聋模型的建立及利水药对模型动物听功能的影响

拟衰老耳聋模型的建立及利水药对模型动物听功能的影响赵丽楠曹筱筱张丹丹茹魏哲杨意闻徐剑指导老师：王静上海中医药大学2005级中西医结合七年制、2006级中西医结合，201203[摘要]目的：探讨拟衰老耳聋动物模型的建立方法，并在此基础上研究利水中药泽泻对于模型动物听功能的影响。方法：选用耳廓声反射良好的白色豚鼠，通过腹腔单独注射D-半乳糖或联用庆大霉素试建立衰老耳聋模型，中药干预组采用泽泻水煎液进行灌胃治疗。实验以过氧化氢酶（CAT）活力作为衰老检测指标，以听性脑干反应（ABR）检测豚鼠听阈的变化。结果：与正常对照组相比，D-半乳糖注射组动物听阈在2K-12K频率范围内均明显下降，但D-半乳糖与GM联用动物听阈较正常对照组无显著性差异，利水药干预组动物与相应D-半乳糖与庆大霉素联用组动物相比，听阈有降低趋势，但无统计学意义。结论：D-半乳糖单独用药即能造成老年性耳聋模型，D-半乳糖与庆大霉素联用模型动物听力下降不明显，提示二者联用可能存在拮抗效应；利水药对D-半乳糖与GM联用模型动物显示一定的治疗作用。[关键词]拟衰老；耳聋；泽泻；D－半乳糖；庆大霉素老年聋是因年龄增长、听觉器官及身体其他不同组织与器官共同发生的缓慢进行性老化过程，并出现听力减退的生理现象，随着社会人口老龄化的加剧，老年聋的发病率也居高不下[1]，研究老年聋具有重要的意义。老年动物模型的建立方法有：臭氧损伤法、D-半乳糖法、胸腺摘除法、快速老化模型等，其中D-半乳糖法操作简单，所需经费少，见效明显，与自然衰老相似，为国内常用的衰老模型造模方法。有文献报道[2]，D-半乳糖可以诱导大鼠内耳拟老化模型，该模型对卡那霉素耳毒性的易感性增强，本研究在此基础上加以修改，采用D-半乳糖单独使用或与庆大霉素（GM）联用建立拟衰老耳聋模型，从而探索可行的老年聋建模方法。中医理论认为，肾开窍于耳，耳为肾之官，肾又为先天之本，主水液代谢。中医多定义老年性耳聋为年老渐致肾虚引起，所以在治疗耳鸣耳聋一证时好投调肾壮肾之品。我们发现，中医从肾论治耳聋的常用方剂如六味地黄汤，耳聋左慈丸，五苓散等，配伍时均选用了泽泻这味利水药。研究发现，泽泻具有利水渗湿作用，能够缓慢穿透内耳，在血-外淋巴及外淋巴-内淋巴之间形成渗透梯度，可促使内淋巴外排，降低内淋巴积水，从而降低内淋巴有害代谢物浓度。因此本研究选用中药常用利水药泽泻，在D-半乳糖以及庆大霉素造成的衰老耳聋动物模型上，观察利水药对模型动物听功能的影响。1.材料与方法：1.1.材料1.1.1实验动物1月龄白色驯化豚鼠110只，250－300g，清洁级，耳廓声反射良好。由上海中医药大学动物房提供。常规饲养1周。1.1.2药物和试剂D-半乳糖（D-gal），25g/瓶，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20080721。硫酸庆大霉素（Gentamicin，GM）注射液，8万单位/2ml，开封制药（集团）有限公司，批号：07040403。中药泽泻，购于上海中医药大学附属曙光医院。试剂盒：过氧化氢酶（CAT）试剂盒，南京建成生物工程公司，批号：20090509。1%戊巴比妥钠，由上海中医药大学教学实验中心提供。1.1.3仪器和设备Neuropack2型诱发电位仪（日本光电公司）80-1离心机电热恒温水浴锅紫外分光光度计其它仪器：电子秤；天平；手术器械等。1.2.方法2.2.1药物制备泽泻的用量参照经典方耳聋左慈丸确定用量，60kg成人标准用量为9g。豚鼠按成人用量的20倍灌胃给药，即用量3g/kg。称取中药泽泻，10倍量双蒸水浸泡2h，武火煮沸后，文火煎煮30min，取药液。再加入8倍量双蒸水浸泡2h，武火煮沸后，文火煎煮30min，取药液。将两次药液合并，纱布过滤，制得中药水煎液。中药水煎液再浓缩至含生药量1.0g/ml。2.2.2动物分组及用药将豚鼠按体重随机分为6组：正常对照组（N组）10只半乳糖衰老模型组（D组）20只半乳糖+GM低剂量组（DGL组）20只半乳糖+GM高剂量组（DGH组）20只半乳糖+GM低剂量+泽泻治疗组（ZXL组）20只半乳糖+GM高剂量+泽泻治疗组（ZXH组）20只除正常对照组外，其它各组用D－半乳糖配置的注射用液以150mg/kg每日腹腔注射，连续51d，建立拟衰老动物，正常对照组每日腹腔注射等量生理盐水。D－半乳糖用药后期20d（32d-51d），对DGL组、ZXL组每日腹腔注射GM40mg/kg，对DGH组、ZXH组每日腹腔注射GM80mg/kg，建立耳聋模型。中药泽泻治疗组ZXL组和ZXH组在腹腔注射GM低、高剂量的同时按3g/kg灌服等量泽泻水煎液，即1ml/kg，从第32d开始连续用药21d，其他组灌服等量饮用水。1.23观察指标①用药过程中，主要对豚鼠进行行为学指标观察，包括豚鼠的体重变化、毛发、行为活动等。②过氧化氢酶（CAT）活力的测定腹主动脉取血，测定豚鼠血清中过氧化氢酶（CAT）的活力。具体操作方法参照南京建成生物工程公司过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒说明书方法测定，单位用U/ml表示。③听性脑干反应（ABR）检测操作在隔音屏蔽室内进行。用1%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉注射（40mg/kg体重），并维持麻醉状态。剪去头顶部的毛，将针电极的正极插入动物头顶正中皮肤，负极插入紧靠右耳外耳道下的皮肤，声刺激通过耳机输入右侧外耳道，刺激声为短音（tonepip）：上升/下降时间为1ms，持续时间为5ms，频率为2-12Hz。NeuropackⅡ系统控制给声及数据收集，叠加1000次，阈值判断以Ⅲ波为准。1.2.4统计方法各组实验数据均用SPSS15.0统计软件作统计学处理，结果以表示，进行单因素方差分析，组间比较用T检验。2.结果2.1行为学观察结果2.1.1D-半乳糖用药4周后，肉眼观察D-半乳糖用药组豚鼠在外观与体重上与正常对照组差别明显，表现为：用药组豚鼠毛发干枯无光泽，有大量脱落，行动迟缓，自发性活动减少，体重明显减轻；正常对照组毛发光亮顺滑，活泼好动，体重增长快。2.1.2DGL组、DGH组、ZXL组和ZXH组从第32d开始注射庆大霉素，1周后，部分豚鼠出现啃食其它豚鼠毛发的奇怪现象，原因不明，可能与庆大霉素和D-半乳糖相互有所反应有关。随用药时间的延长，豚鼠死亡数量逐渐增多，身体健康状况不佳。2.2过氧化氢酶（CAT）活力检测结果（见表1）由表1可见，D组CAT酶活力较正常组明显下降，但由于样本数太小，无法进行统计学比较。其他组与正常对照组相比，CAT活力无统计学差异。取样少的原因：D-半乳糖对机体损伤大，实验过程中该组豚鼠死亡较多，D-组豚鼠精神状态差，腹腔取血时大多腹膜粘连和肠粘连严重，腹腔积水多（见图2），局部有出血情况，加之血液粘稠，较正常豚鼠更易凝血，取血困难。表1CAT活力检测（U/ml）组别nN组75.12±5.98D组21.17±3.7DGL组56.04±6.16DGH组814.24±17.07ZXL组84.18±6.61ZXH组77.07±5.920246810121416NDDGLDGHZXLZXHCAT活力U/ml图1各组CAT活力比较图2D组豚鼠打开腹腔后照片2.3不同造模方法致ABR反应阈的改变（见表2、表3）由表2、表3可以看出，D-半乳糖以150mg/kg日剂量连续用药51d能够使得豚鼠听性脑干反应阈值较正常对照组明显升高，造成中度聋耳聋模型，造模成功率为72.7％（TS10dBSPL）。D-半乳糖与不同剂量庆大霉素联合用药组动物，除低剂量组有1只动物出现明显耳聋，高剂量组有2只动物出现轻度耳聋外，其他动物均听力正常，表明D-半乳糖与庆大霉素联用可能不能有效造成耳聋模型。表2造模后D组、DGL组、DGH组ABR阈移（thresholdshift,TS=T造模组-T正常对照组均值，dBSPL）组别例数2k4k6k8k10k12kD组1128.71±33.72*31.52±36.07*36.29±28.94**33.18±29.60**40.30±33.99**46.82±32.88**DGL组88.45±22.819.05±15.9210.12±20.505.83±25.3817.50±26.7220.83±27.46DGH组112.50±8.164.17±8.610.83±7.07-6.00±5.487.67±7.4212.00±7.58注：*p0.05，**p0.005。表3造模后动物听功能改变分布组别TS10dBSPL10TS2020TS40TS40D组27.3％18.2％9.1％45.4％DGL组87.5％0012.5％DGH组81.8％18.2％00注：以2～12k中阈移最大者为准。-20.00-10.000.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.002K4K6K8K10K12K频率阈移dBSPLD组DGL组DGH组图3不同造模方法致ABR反应阈的改变2.4泽泻对D-半乳糖与GM联用模型动物听功能的影响（见表4、表5）本实验结果显示，ZXL组连续进行泽泻灌胃21d后，阈移与DGL组相比有降低的趋势，显示利水药对老年药毒性耳聋有一定疗效。而ZXH组连续用药泽泻21d的听阈与DGH组相比听阈无明显差异。结果提示庆大霉素与D-半乳糖联**********合用药可能产生拮抗作用，导致毒性降低，拟进行进一步研究分析。表4造模后各组ABR阈移（thresholdshift,TS=T造模组-T正常对照组均值，dBSPL）组别例数2k4k6k8k10k12kDGL组88.45±22.819.05±15.9210.12±20.505.83±25.3817.50±26.7220.83±27.46ZXL组100.17±15.24-1.67±15.63-0.67±14.35-5±14.727.67±14.4910±16.33表5造模后各组ABR阈移（thresholdshift,TS=T造模组-T正常对照组均值，dBSPL）组别例数2k4k6k8k10k12kDGH组62.5±8.164.17±8.610.83±7.07-6±5.487.67±7.4212±7.58ZXH组6-3.33±7.58-7.5±3.76*-4.17±7.75-6.67±7.532.5±8.6112.5±8.8-10.000.0010.0020.0030.0040.0050.0060.002K4K6K8K10K12K频率阈移dBSPLDGL组ZXL组图4DGL组合ZXL组阈移比较-10.00-5.000.005.0010.0015.0020.0025.002K4K6K8K10K12K频率阈移dBSPLDGH组ZXH组图5DGH组合ZXH组阈移比较3.讨论D-半乳糖亚急性衰老动物根据衰老代谢紊乱学说研制而成，方法是一定时间内给动物连续注射D-半乳糖，引起体内糖代谢紊乱，使得动物多种组织、器官形态及生理、生化指标出现明显变化，呈现与自然衰老相似的改变，这一过程与自然衰老相似。氨基糖苷类抗生素耳毒性作用的发生机制主要有以下几种学说：蓄积中毒学说；屏障受损学说；线粒体损伤学说；自由基和活性氧的大量产生；钙蛋白酶与钙超载学说；细胞凋亡学说等。本实验采用2种工具药进行单独或联合用药，尝试建立老年性耳聋模型，现就具体结果分别讨论如下：3.1模型衰老程度讨论对于实验动物衰老程度的检测采用过氧化氢酶（CAT）试剂盒检测。具体方法严格按照说明书操作。1）D-半乳糖组CAT活力与正常组相比有所降低，可以初步判断D-半乳糖对衰老大鼠造模成功，但是由于该组豚鼠实验后期死亡数量多，采血样本少，此结果不具有说服力，P0.05，不具有统计学意义。分析原因，可能为D-半乳糖用药时间长，对机体毒性强损伤大，豚鼠对D-半乳糖的耐受不高等因素，导致该组豚鼠精神状态差。腹腔取血时大多数豚鼠腹膜粘连和肠粘连严重，腹腔积水多，有些还有局部出血情况，加之血液粘稠，易凝血，造成取血困难。2）D-半乳糖与不同剂量庆大霉素共同用药组的动物CAT活力有偏高的趋势，但无统计学差异（