血液分析仪检验18

血液分析仪检验自动血液分析仪（AHA）[血细胞计数仪（bloodcellcounter）],是临床检验最常用的筛检仪器之一。传统的显微镜血细胞计数或分类方法:速度慢、误差大、影响因素多，且难以满足临床大量标本检测需求。AHA可进行：①全血细胞计数及其相关参数的计算。②白细胞分类。③血细胞计数和分类的扩展功能，包括：有核红细胞计数、网织红细胞计数及其相关参数检测；幼稚粒细胞、未成熟粒细胞、造血干细胞计数；未成熟血小板比率；淋巴细胞亚型计数；细胞免疫表型检测等。第一节血液分析仪的检测原理现代血液分析仪综合应用了电学和光（化）学两大原理，用以测定血液有形成分（细胞）和细胞内容物（血红蛋白）。电学检测原理包括电阻抗法和射频电导法；光（化）学检测原理包括激光散射法和分光光度法。激光散射法检测的对象有2类：染色的和非染色的细胞核、胞质颗粒等成分。一、电学检测原理1．电阻抗法即库尔特原理（图3-1）。电阻抗法是三分群血液分析仪的核心技术，可准确测出细胞（或类似颗粒）的大小和数量。电阻抗法还与其他检测原理组合应用于五分类血液分析仪中。图3-1电阻抗法细胞计数原理为提高计数准确性，部分仪器还采用3次计数、扫流和拟合曲线等技术进行血小板计数（图3-3）。电阻抗法还可用于白细胞计数及白细胞三分群分析。例如，电阻抗法红细胞计数和血小板计数是在相应通道内进行计数，并根据二者体积不同，采用浮动界标法进行区分（图3-2）。图3-2电阻抗法正常红细胞直方图图3-3电阻抗法正常血小板计数和拟合曲线直方图2．射频电导法高频电流能通过细胞膜，用高频电磁探针渗入细胞膜脂质层，测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、胞核和胞质（如比例）、颗粒成分（如大小和密度）等特征性信息。电导性特别有助于鉴别体积相同、但内部结构不同的细胞（或相似体积的颗粒。图3-4射频电流检测原理（二）光（化）学检测原理1．激光散射法将稀释、染色（化学染色或核酸荧光染色）、球形化的细胞悬液注入鞘液流中央，单个细胞沿着悬液和鞘液流两股液流整齐排列，以恒定流速定向通过石英毛细管，即流体动力学聚焦技术（图3-5）。图3-5鞘流技术当细胞（或颗粒）通过激光束被照射时，因其本身的特性（如体积、染色程度、细胞内容物大小及含量、细胞核密度等），可阻挡或改变激光束的方向，产生与其特征相应的各种角度的散射光（表3-1）。放置在石英毛细管周围不同角度的信号检测器（光电倍增管）可接收特征各异的散射光（图3-6）。图3-6流式细胞术检测通道和光路系统用于血液分析仪检测的光散射分析理论是采用Mie同质性球体光散射理论。例如，红细胞/血小板经十二烷基硫酸钠和戊二醛固定呈球形后，采用流式细胞术激光散射法进行红细胞数量和相关参数的分析，其散点图见图3-7和图3-8。图3-7线性化红细胞体积/血红蛋白浓度（V/HC）散点图图3-8光散射法血小板计数和红细胞计数散点图用于血液分析仪检测的染料分为荧光染料和非荧光染料。荧光染料有：碱性槐黄、噻唑橙、噁嗪、聚亚甲基蓝和碘化丙啶等，主要用于核酸染色，被激光照射后产生荧光和散射光，如采用荧光染料和激光散射法原理进行的网织红细胞计数（图3-9）。图3-9噻唑橙荧光染色网织红细胞检测散点图非荧光染料有：亚甲基蓝（用于核酸染色）氯唑黑E（用于单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞颗粒和白细胞的膜结构染色）过氧化物酶试剂。经过染色的细胞随鞘液流经激光检测区时，被染色部分可发生光吸收现象，使光检测器接收到的散射光强度发生改变，从而区分细胞的种类。2．分光光度法主要用于血红蛋白测定。用于血红蛋白测定的溶血剂有2大类：①改良氰化高铁血红蛋白溶血剂：测定波长为540nm，稀释液含氰化物成分。②非氰化高铁血红蛋白溶血剂：即稀释液不含氰化物成分。如SLS-Hb法，测定波长为555nm。经HiCN法校准后，既可达到与HiCN法相当的精密度和准确性，又可避免HiCN法的试剂对检验人员的潜在危害和对环境的污染。（三）血液分析仪检测原理的综合应用1．VCS技术在白细胞检测通道，红细胞被溶解，白细胞接近自然状态。应用VCS技术检测白细胞大小、结构特点等（表3-2），并形成三维散点图（图3-10，图3-11）。VCS技术检测病理性异常细胞的散点图位置见图3-12。图3-10体积（V）、电导（C）和光散射（S）法图3-11VCS细胞检测立体散点图图3-12VCS异常细胞检测平面散点图位置目前，该技术也可用于网织红细胞计数（图3-13）和有核红细胞的计数。如网织红细胞计数时，采用“透明剂”使红细胞内血红蛋白溢出形成“影细胞”，再用新亚甲蓝对网织红细胞RNA进行染色，采用VCS技术测定和分析网织红细胞。图3-13VCS原理新亚甲蓝染色网织红细胞散点图2．电阻抗、射频、流式细胞术和核酸荧光染色方法（1）4DIFF通道：利用半导体激光流式细胞术、核酸荧光染色技术，采用溶血剂完全溶解红细胞和血小板，白细胞膜仅部分溶解。聚亚甲基蓝核酸荧光染料进入白细胞内，使DNA、RNA和细胞器着色。因为荧光强度与细胞内核酸含量成比例，所以未成熟粒细胞、异常细胞荧光染色深，成熟白细胞荧光染色浅，从而得到4DIFF白细胞散点图（图3-14）。图3-14白细胞分类—4DIFF散点图（2）WBC/BASO通道：在碱性溶血剂作用下，除嗜碱性粒细胞外的其他所有细胞均被溶解或萎缩，经流式细胞术计数，可得到WBC/嗜碱性粒细胞百分率和绝对值及WBC/BASO散点图（图3-15）。图3-15白细胞分类—WBC/BASO散点图（3）未成熟髓细胞信息通道：采用射频、电阻抗和特殊试剂结合法。在细胞悬液中加硫化氨基酸，幼稚细胞膜脂质含量高，结合硫化氨基酸的量多于较成熟的细胞，对溶血剂有抵抗作用。加入溶血剂后，成熟细胞被溶解，只留下幼稚细胞和异型/异常淋巴细胞（图3-16），报告百分率和绝对值，并提示核左移。图3-16未成熟粒细胞信息通道散点图3．钨光源散射与细胞化学方法（1）过氧化物酶染色通道：在白细胞通道加入溶血剂和POX染色剂，可计算MPXI，得到嗜酸性粒细胞、中性粒细胞或单核细胞的相对POX活性。形成以POX分布强度为X轴、以细胞体积为Y轴的散点图（图3-17），进行白细胞计数与分类。图3-17白细胞（N、L、M、E）POX染色散点图（2）嗜碱性粒细胞/核分叶性通道：苯二酸完全破坏红细胞和血小板；除嗜碱性粒细胞外，其他白细胞膜溶解，胞质溢出，仅剩裸核。完整的嗜碱性粒细胞呈高角度散射，位于散点图上部；裸核则位于下部，可进行白细胞计数和嗜碱性粒细胞计数。根据不同细胞的裸核结构进行白细胞分类计数（图3-18）。图3-18嗜碱性粒细胞—核分叶性散点图根据多分叶核（PMN）和单个核（MN）的比例，可计算出核左移指数（LI）。LI越高，说明核左移程度越大。目前该技术也可用于有核红细胞的计数（图3-19）。图3-19嗜碱性粒细胞染色/分叶核细胞通道有核红细胞散点图（3）未染色大细胞计数（LUC）检测：在POX通道，可检测到无POX活性、体积大于正常淋巴细胞体积平均值2个标准差的细胞，如异型淋巴细胞、浆细胞、毛细胞、幼稚淋巴细胞和原始细胞。4．多角度偏振光散射方法多角度偏振光散射法（MAPSS）应用（氦氖）激光流式细胞术，分4个角度（图3-20）检测细胞（表3-3-1、图3-21、图3-22、图3-23）。嗜酸性粒细胞颗粒丰富，可消除偏振光，以此中性粒细胞相鉴别。图3-20多角度偏振光散射法模式图图3-210°前向散射光，7°侧向散射光图3-2290°垂直角度散射光（偏振光）图3-2390°垂直角度消偏振散射光（去偏振光），90°垂直角度散射光（偏振光）鞘液中的DNA染料碘化丙啶可破坏有核红细胞膜，只留下裸核而将其染色。染料对有活性的白细胞只有极小渗透性或无渗透性，故其细胞核不染色。通过多散点图分析（MSA），可鉴别有核红细胞、无活性白细胞和脆性白细胞，计算活性白细胞比率和计数有核红细胞（图3-24）。图3-24碘化丙啶荧光染色有核红细胞散点图5．双流体（双鞘流）技术和细胞化学染色方法（1）嗜碱性粒细胞通道：专用染液染色，嗜碱性粒细胞具有抗酸性，染色后保持原有形态与结构，而其他细胞的胞质溢出，成为裸核。采用电阻抗法检测，所得结果与白细胞/血红蛋白通道的白细胞（鞘流阻抗法）结果进行比较（图3-25）。图3-25嗜碱性粒细胞计数直方图（2）其他白细胞分类通道：检测除嗜碱性粒细胞以外的各类白细胞。结合了钨光源流式细胞光吸收、化学染色和电阻抗法（图3-26）。DHSS采用2个鞘流装置分析细胞内部结构（图3-27）。双矩阵LIC散点图可将幼稚细胞分为3个亚群（图3-28）。图3-26白细胞分类计数散点图图3-27双鞘流图图3-28双矩阵巨大未成熟细胞（LIC）散点图（IMG：未成熟粒细胞，IMM：未成熟单核细胞，IML：未成熟淋巴细胞）四、血液分析仪检测参数及原理不同类型血液分析仪检测参数的原理不尽相同。高档仪器应用2种或2种以上检测原理，组合电学、光学、细胞化学等技术，在独特检测通道测定红细胞、血小板和白细胞系列的数量、亚类及相关参数（表3-4、表3-5）。第二节血液分析仪检测参数和结果显示一、血液分析仪检测参数血液分析仪检测参数包括：临床报告参数、异常报警或研究参数、仪器内部监测参数3类。血液分析仪检测的总体目标有2个：一是筛检和直接报告正常检验结果，二是在出现异常结果时，直接向检验人员报警。随着检测技术的发展和临床循证检验医学证据的建立，目前用于报警和研究的参数，有可能转为能应用于临床检测的新参数。二、血液分析仪结果显示血液分析仪检测标本后，结果显示通常有3种形式：数据、图形和报警。（一）数据凡可向临床报告的检测参数，一般均以检验报告单的形式显示，可按原样和特殊格式打印，并向临床发出或传送结果。当检测结果超出参考区间时，仪器会给予符号标记（↑表示增高，↓表示降低），或用特定颜色（如红色表示增高，蓝色表示降低）加以提示。对于无法直接报告的结果，也有相应的符号提示。有报警或结果异常的参数，经检验人员复查、确定后，方可发出报告。（二）图形血液分析仪常用的图形有2种：直方图和散点图。1．直方图（1）白细胞直方图：电阻抗型血液分析仪，在35～450fl范围内将白细胞分为3群。正常白细胞直方图（图3-29）。出现异常直方图时，常伴随相应部位的报警信号，并有相应的图形改变（图3-30～图3-34）。图3-29正常白细胞直方图及异常时曲线形态改变主要位置（R1～R4）图3-30原始、幼稚白细胞增多直方图图3-31淋巴细胞减少和中性粒细胞增多直方图图3-32淋巴细胞增多和中性粒细胞减少直方图图3-33中间细胞（单个核细胞）群增多直方图图3-34单个核细胞绝对增多直方图（2）红细胞直方图：正常红细胞直方图（图3-2）是一条近似正态分布的单峰曲线，通常位于36～360fl范围内，横坐标表示红细胞体积，纵坐标表示不同体积红细胞出现的频率。异常直方图见图3-35～图-37。图3-2正常红细胞直方图图3-35小红细胞且大小不均直方图图3-36巨红细胞且大小不均直方图图3-37巨幼细胞性贫血治疗有效直方图（呈双峰）（3）血小板直方图：正常血小板直方图是一个偏态分布的单峰光滑曲线，通常在2～30fl范围内，主要集中在2～15fl。当血标本中存在大血小板、血小板聚集、小红细胞、红细胞碎片时，可出现异常血小板直方图（图3-38）。图3-38大血小板增多直方图2．散点图不同型号血液分析仪由于应用光散射原理不同，即使是正常红细胞、白细胞或血小板的散点图表达形式也有明显区别。通常，平面散点图只显示二维（X、Y轴）图像，而三维（X、Y、Z轴）图像则显示立体图像。在二维坐标系中，横坐标（X轴）和纵坐标（Y轴）分别表示一种检测原理或检测角度的细胞信息，位于坐标象限中的任何一个散点反映的就是X轴和Y轴的综合信息。（三）报警1．报警的概念血液分析仪的功能主要有3项：①筛检和报告正常检测结果，此时，一般不出现任何报警。②技术条件已成熟，被FDA批准、并在仪器或实验室设定的检测项目规则内作出报告时，也可无报警。但在多数情况下仍出现