生物显微技术复习资料

第二章显微镜及其附加设备第一节显微镜的光学原理放大镜放大镜的放大率公式，通常采用以下形式：Γ=250/f′由上式可知，放大镜的放大率仅由其焦距所决定，焦距越小则放大率越大。由于单透镜有相差存在，加上加工的原因，不能期望以减少凸透镜的焦距来获得很大的放大率。简单放大镜放大率都在10×以下。构造相对复杂的为解剖显微镜，它由几个透镜组成，其放大率在200×以下。放大镜的放大倍数越高，其焦距越短，工作距离也越短。凸透镜的成像规律为：若u2f，则2fvf，异侧倒立缩小的实像若2fuf，则v2f，异侧倒立放大的实像若u=f，则v→∞，不成相若uf，则同侧正立放大的虚像分辨率分辨率是指能区分两个物点间最小距离的能力。两物点间的最小距离称为分辨距离。分辨距离越小，分辨率越高，也就是分辨细微结构的能力越大。普通光学显微镜分辨率的极限是0.2μm。可把物体放大1500倍。放大率放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。总放大率=物镜放大率×目镜放大率显微镜的放大倍数是指对物体长度的放大。显微镜放大率公式：Γ=250Δ/f1f2式中：Δ为光学筒长，一般为160mm；250为明视距离，单位为mm；f1为物镜的焦距；f2为目镜的焦距。在考虑其总放大倍率的同时，首先应选取所用物镜的放大倍数，其次才考虑目镜的放大倍数。其原因在于显微镜的成像质量主要取决于物镜的分辨率。镜口角孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。数值孔径数值孔径（NA）：是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率和孔径角半数的正玄之乘积。用公式表示如下：NA=hsinu/2。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。降低波长λ值，使用短波长光源。增大介质n值和提高NA值。增大孔径角。增加明暗反差。焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。焦深大，分辨率降低。镜像亮度镜像亮度是指显微镜观察中的图像明暗程度。NA值越大，镜像的亮度就越大，总放大倍数就越好。视场亮度视场亮度是显微镜所观察的整个视场（或视野）的明暗程度。它与物镜、目镜、聚光镜、视场光阑、光源等因素有关。视场亮度大，镜像亮度大。视场直径视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径23最为科学，大视场容易引起场曲。F=FN/M;F:视场直径，FN：视场数，M:物镜放大率。视场数（FieldNumber,简写为FN），标刻在目镜的镜筒外侧。由公式可看出：1．视场直径与视场数成正比。2．增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。覆盖度覆盖度：显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm,许可范围在0.16-0.18mm.,工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。平时习惯所说的调焦？机械筒长从镜筒的肩部（目镜下缘）到物镜螺旋肩部之间的长度叫机械筒长，一般它的长度为160mm。焦点：决定图像是模糊还是清晰？焦点与焦距有关，且可以通过聚焦旋钮控制。样本载玻片上的盖片厚度也会影响图像对焦。正确的盖片厚度应标注在物镜的侧面。分辨率：图像中的两个像素达到多近的间距时会分辨不清？分辨率与物镜的数值孔径（数值孔径越大，分辨率越高）以及通过透镜的光线波长（波长越短，分辨率越好）有关。调节不同参数产生的效果亮度：表示图像有多明亮？亮度与照明系统相关，因而可以通过改变灯的电压/电阻器，以及调节聚光器和光圈/针孔孔径进行更改。此外，亮度还与物镜的数值孔径有关（数值孔径越大，图像越明亮）。对比度：样本周围区域的光照差别怎样？对比度与照明系统相关，可以通过改变光线强度以及光圈/针孔孔径对其进行调节。除此之外，对样本进行化学着色也可以增强对比度。明视距离从眼球的水晶体到放大的虚像之间的距离叫明视距离，它的长度为250mm，这是观察显微镜中物像最适宜的距离。一、物镜物镜分前透镜和后透镜。高倍镜为弹簧物镜。（一）几个概念1、齐焦反映某一倍数的物镜观察图像清晰后，在转换至另一倍率的物镜时，其成像亦应基本清晰，且物镜光路也基本合轴，中心不偏离。2、色差3、球差4、场曲2、透镜的像差某一物点发出的光束，经过透镜以后，仍然是同心光束，还都会聚在一点，由这种方式形成的像点称为理想像点。由理想像点构成与原物形状、颜色完全相似的像，称为理想像。实际上，从一点发出的光束在通过透镜后并不完全会聚于一点，而是分布在空间一个很小的区域内，成为一个模糊的斑点或称弥散圈。同样，一个物体通过透镜后也不可能形成一个与原物体完全相似的像。造成这些缺陷的主要原因是透镜本身存在的各种像差。像差单色相差轴上点的单色像差――球差慧差像散轴外点的单色像差―场曲畸变复色像差――－－－－色差1）轴上点的单色像差――球差由光轴上一点发出的光线经透镜折射后，不再是同心光束，入射光线的孔径角不同，其出射光线与光轴交点的位置就不同，相对于理想像点有不同的偏离，这就是球差。孔径角越大，则光线的折射率越大。球差及球差的消除球差球差也称球面差、球面像差，指透过透镜边缘的光线曲折度大于透过中央部分的现象，会聚的焦点参差不齐，使成像不清晰，有时变形。2）轴外点的单色像差（1）慧差慧差即慧形像差，又叫侧面球差。它是光轴外一点发出宽光束通过透镜折射会聚所形成的一种像差。其形成原因是由于透镜边缘一带的光线与透镜主轴一带的光线所会聚的焦点位置和影像大小有差别。得到的影像的一端宽大虚散而较暗，另一端则窄小清晰而较亮，严重影响图像的清晰度。慧差(Coma)靠近光轴的物点发出的大孔径光线不聚焦于一点Y慧差的校正：复合透镜；非球面透镜；2）轴外点的单色像差2）像散当轴外一点发出很细的光束投射在透镜上成像时，由于细光束的光束轴与法线不重合，其出射光束不再存在对称轴，而只存在一个对称面（子午面）。与此细光束对应的微小波面并非旋转对称，在不同方向上有不同的曲率，因此形成像散光束。存在着像散的光学系统，不能使物面上所有物点形成清晰的像点群。（3）场曲：即像场弯曲。每个物点都能得到一个清晰的像点，但是整个像面不是一个平面，而是一个回转曲面。因此，像平面是不清晰的。当使用存在场曲的镜头拍摄时，如果景物中间部分清晰，则边缘部分模糊；反之，当景物边缘部分清晰时，则中间部分模糊。场曲：曲也称像场弯曲，指整个像平面是一个曲面，这样的像平面是不清晰地。（4）畸变产生畸变的原因是在一对物、像共轭平面上，垂轴放大率随视场大小而改变，不再保持常数，使像相对于物失去了相似性。如果主光线和高斯像面焦点的高度随视场增大而大于理想像高，即为正畸变，又叫枕形畸变；如果主光线和高斯像面焦点的高度随视场增大而小于理想像高，即为负畸变，又叫桶形畸变。3）复色像差－－色差1.位置色差描述轴上物点用不同色光成像时成像位置差异的像差称为位置色差，也称为轴向色差。同一透镜对不同色光有不同焦距。当透镜对于光轴上一点成像时，按色光的波长的由短到长，每种色光形成的像点离开透镜由近到远地排列在光轴上，这就是位置色差。2.倍率色差当光学系统校正了位置色差以后，可认为两种色光的像面重合在一起。但对于轴外点来说，由于不同色光的焦距不等而放大率不等，因而有不同的像高。光学系统对不同色光的放大率的差异称为倍率色差，也称放大率色差或垂轴色差。倍率色差破坏轴外点像的清晰程度，造成白色像的模糊。色差的消除色差是指光线通过一个透镜后，不能使所有颜色的光都聚在一个焦点上，而是残次不齐的。（二）物镜种类功能：a产生物体的第一次倒立实像b放大作用1.按介质来分：干燥系物镜油浸系物镜水浸系物镜油镜的使用方法(1)首先用低倍干系物镜找出要观察的区域。(2)当标本被照明时，把一滴(不要多于一滴)浸油准确地滴到盖玻片上的照明区域，并注意不要在滴入的浸油里混有气泡。(3)在现代显微镜中，用干系物镜聚焦标本后可以在不改变粗调和细调的情况下转动物镜转换台直接把油浸物镜浸到油里。(4)当油浸物镜已经浸入浸油之后，用细调进行进一步的调节直到像被清晰地聚焦，并在细调旋钮的刻度尺上记下所转动的刻度。当第一次聚焦使用固定的低倍干系物镜时，每次使用油浸物镜的聚焦都需要相同的调节，即沿着同样的方向使细调转动相同的刻度。2.物镜种类消色差物镜Ach消除红蓝光的色差，由含铅的火石玻璃单凹透镜粘合成复消色差物镜APO：能消除红、绿、蓝光的色差，校正红蓝二色光的球差。特种玻璃或萤石、氟石等材料制成半复消色差物镜FL：校正红蓝二色光的色差和球差，氟石等材料制成平场物镜Plan：增加一块半月形的厚透镜，视场平坦，视场较大，工作距离也增大。PlanAch、PlanAPO、SPlan、SPLanAPO特种物镜带校正环物镜带彩虹光阑的物镜相衬显微镜（ph）无应变物镜（PO或POL）无荧光显微镜（UVFL）无罩物镜（NC）长工作距离物镜（倒置）170；表示所适用的显微镜机械筒长，即从物镜的肩部到目镜上缘的距离为170mm。0.17：表示物镜所要求的盖玻片厚度为0.17mm。PLAPo；表示物镜的矫正程度为平面复消色差，NPL表示标准平面消色差。100(或40)：表示物镜的放大倍数为100(或40)倍。Oil；表示物镜的浸润介质为油浸。物镜没有标记这种字母，表示介质为空气的干系物镜。0.65：表示物镜的数值孔径(即镜口率)为0.65，这是决定物镜性能的非常重要的参数。二、目镜：目镜分接目镜和场目镜眼点：从目镜透射出来的光线，在目镜的接目镜以上形成的交叉点。作用：a、将物镜形成的倒立实像变成正立的虚像。b、将像再放大4-16倍。目镜的种类惠更斯目镜（平凸同向）冉姆斯登目镜（平凸相对）凯尔勒目镜（目镜胶合）补偿目镜（补偿色差，高倍镜使用）照相目镜（负焦点目镜）平场目镜（增加一块负透镜，p或plan）广视野目镜（W或WF或WHF）对于一个戴眼镜的工作者来说，在进行显微观察时应该戴着眼镜还是应该摘去眼镜呢？一般说来摘去比较合适。大多数标准目镜的出瞳高度为6-12mm，而眼睛的瞳孔一般距眼镜玻璃片12-14mm，再加上镜片的厚度，这就大大地超过了显微镜的出瞳高度，使得眼睛错过了整个视场。此外，当眼镜尽可能地贴近目镜时，由于眼镜与目镜的相互接触和摩擦，就会损伤目镜前透镜和眼镜镜片。三、聚光器透镜组和孔径光阑装置组成可调焦暗场、偏光、相衬、微分干涉、长工作距离聚光器四、载物台和光源12单色光照明亮度；具有足够大的发光表面。光源是40一60w的高压白炽钨灯。现在经常用于显微镜的是12v或6v的低电压灯泡，这种灯泡具有15—60w或更高的功率。自然光源在使用高倍观察当像的亮度不足的情况，应该使用40w的高压灯泡还是100w的高压灯泡？照明方式透射式照明落射式照明1.光源2.聚光透镜3.孔径光阑4.视场光圈5.聚光透镜6.半透膜反射镜7.物镜8.被检物体9.至中间像面光路照明方法临界照明是通过乳白灯泡的照明表面或场玻璃屏直接照明物体，照明的光锥可以通过在集光器入瞳处的孔径光阑而控制，照明区域的大小是通过视场光阐来调节的。1）物场上光的强度不均匀；（2）当使用低放大倍数时像的亮度太强。科勒照明把一个