05第五章 核酸化学

核酸化学核酸化学核酸的种类和分布1核酸的结构2核酸的物理化学性质3现代核酸技术(分离、纯化技术)4核酸化学1.核酸的种类和分布核酸概述1.在1869年，瑞士外科医生F.Mischer从细胞核中分离得到一种含磷丰富的酸性物质，称为“核素”，即现在被称为核酸的物质。2.1889年命名为“核酸”，即细胞核内的酸性物质。3.1909年，A.Kossel发现核酸的四种碱基，组成单位(核苷酸)；P.A.Levene研究了核糖、脱氧核糖4.1939年，E.Knapp等第一次用实验方法证实核酸是生命遗传的基础物质。5.1944年，OswaldAvery提出遗传的物质基础是DNA(肺炎双球菌)6.1951年，在X射线衍射技术支持下结构澄清。7.1953年，Waston&Click提出DNA的双螺旋模型。核酸是存在于细胞中的一类大分子酸性物质，包括:以核苷酸为基本单位所组成的多核苷酸长链。DNA则是遗传信息的载体RNA主要参与遗传信息的表达脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）1.1核酸的分类核酸脱氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid按照组成核酸分子的戊糖的结构不同分为：DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。DNA为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构(细菌的DNA)。脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。作为遗传物质H1N1RNA分类RNAmRNAtRNArRNA其他RNAsnRNAsnoRNAscRNAantiRNA•约占总RNA的5%•不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大•它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成工厂-核糖体•约占总RNA的10～15%•它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖体的作用•已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA•tRNA分子的大小很相似，链长一般在73-90个核苷酸之间•约占全部RNA的80%•是核糖体的主要组成部分•rRNA的功能与蛋白质生物合成相关mRNAtRNArRNA1.2证明DNA是主要遗传物质的证据1944年，O.Avery肺炎双球菌转化实验1952年，A.DHershey和M.Chase噬菌体感染实验肺炎双球菌转化实验活的滑面病毒加热杀死的滑面病毒活的粗面病毒肺炎双球菌转化实验加热杀死的滑面病毒活的粗面病毒32P-DNA35S-蛋白质噬菌体感染实验1.3核酸的化学组成核苷酸核酸磷酸核苷戊糖碱基水解1.3.1碱基RNADNA嘧啶环（Py）嘌呤环（Pu）尿嘧啶U胸腺嘧啶T胞嘧啶C鸟嘌呤G腺嘌呤A碱基的酮式-烯醇式，酰胺-亚氨醇式互变异构胺式-亚胺式互变异构：酮式-烯醇式GUT胺式-亚胺式ACUC1.3.2戊糖β-D-呋喃核糖(inRNA)β-D-2’-呋喃脱氧核糖(inDNA)1.3.3稀有碱基都是基本碱基的化学修饰型，如：嘌呤：次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤嘧啶：5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶4-巯尿嘧啶（I）（m1I）碱基修饰稀有碱基基本AA不常见的蛋白AANNNNONH2H鸟嘌呤NNNNOH次黄嘌呤（I）1-甲基次黄嘌呤（m1I）NNNNOH稀有碱基(修饰流程示例)CH3－5-甲基胞嘧啶6-甲氨基腺嘌呤N2、N2-二甲基鸟嘌呤5-羟甲基胞嘧啶稀有碱基(修饰碱基)m22,2Gm5Chm5CCH37-甲基鸟嘌呤4-硫尿嘧啶稀有碱基(修饰碱基)s4Um7G1.3.4核苷核苷:是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的苷类化合物在大多数情况下，核苷是由核糖或脱氧核糖的C1’β-苷羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合(N-C键)，故生成的化学键称为β-N-糖苷键碱基被修饰核糖的C2位置被甲基化碱基与核糖链接方式不同（假尿嘧啶）修饰核苷核苷腺苷(AR)脱氧胞苷(dCR)β-1’,N9-糖苷键β-1’,N1-糖苷键假尿苷（ψ）β-1’,C5-糖苷键C1N9C1N3或N1564321RNA中四种DNA中四种1.3.5核苷酸的结构与命名核苷酸:是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类。由于与磷酸基缩合的位置不同而分别生成2’-核苷酸、3’-核苷酸和5’-核苷酸。最常见者为5’-核苷酸（5’常被省略）。核糖核苷酸：2’-核苷酸、3’-核苷酸和5’-核苷酸脱氧核糖核苷酸：3’-核苷酸和5’-核苷酸核苷酸的分子结构腺嘌呤核苷酸AMP鸟嘌呤核苷酸GMP胞嘧啶核苷酸CMP尿嘧啶核苷酸UMP次黄嘌呤核苷酸IMP5’-核苷酸：又可按其在5’位缩合的磷酸基的多少，分为一磷酸核苷酸（NMP）、二磷酸核苷酸(NDP)和三磷酸核苷酸(NTP)。AMPADPATP1.3.6核苷酸的衍生物（1）ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)1.ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物2.ATP含有两个高能磷酸键。ATP水解时,可以释放出大量自由能3.ATP是生物体内最重要的能量转换中间体。用于推动生物体内各种需能的生化反应4.ATP也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤（2）GTP(鸟嘌呤核糖核苷三磷酸)GTP是生物体内游离存在的另一种重要的核苷酸衍生物。它具有ATP类似的结构,也是一种高能化合物。GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下,ATP和GTP可以相互转换。（3）环核苷酸的分子结构环一磷酸腺苷环一磷酸鸟苷一分子的核苷酸的3’-位羟基与另一分子核苷酸的5’-位磷酸基通过脱水可形成3’,5’-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。2.核酸的结构2.1核酸的一级结构2.1.1多核苷酸链核酸就是由许多核苷酸单位通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。核酸具有方向性的长链状化合物，多核苷酸链的两端，一端称为5’-端，另一端称为3’-端。碱基编号：1，2，3，4…..核糖编号：1’，2’，3’，4’，5’……在多聚核苷酸中，两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键通常称为3’,5’-磷酸二酯键多聚核苷酸链一端的C5′带有一个自由磷酸基，称为5′-磷酸端（常用5’-P表示）；另一端C3’带有自由的羟基，称为3′-羟基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是5′→3′或是3′→5′多核苷酸链的特点：5’-AGTCCATG-3’反向AGTCCATG正向GTACCTGA2.1.2核酸一级结构的表示方法5′--AGCT--3′AGTCPPPP1.直接用碱基表示（字母式缩写）2.线条式缩写DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。2.2DNA的结构P130二级结构DNARNA目前已知DNA双螺旋结构可分为A、B、C、D及Z型等数种，除Z型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺旋DNA结构的多态性类型结晶状态螺距堆积距离每螺旋碱基数目碱基夹角A75%相对湿度，钠盐2.8nm0.25nm1132.7B92%相对湿度，钠盐3.4nm0.34nm1036C60%相对湿度，钠盐3.1nm0.33nm9.338类型旋转方向直径螺距堆积距离每螺旋碱基数目碱基夹角Z左旋1.84nm4.5nm0.38nm12-60B右旋2.37nm3.4nm0.34nm1036P136不同DNA的碱基摩尔比DNA来源ATGCm5CA＋CC+T+m5CA＋C+m5CG+TTAGC+m5C小牛胸腺28.227.821.521.21.30.991.011.010.96大白鼠骨髓28.628.421.420.41.11.001.001.001.00小麦胚27.327.122.716.86.01.001.001.011.00酵母31.332.918.717.11.000.940.951.09噬菌体T530.330.819.519.50.990.970.981.00人结核分支杆菌15.114.634.935.41.001.021.030.99噬菌体X17424.332.324.518.2P1342.2.1DNA的一级结构DNA，脱氧核糖核酸，作为遗传物质的载体，相对分子量较大大肠杆菌（E.coil）DNA的分子量为2.8×109，含3.8×106bpDNA大多为线形分子，少数病毒（如噬菌体X174、M13）及高等植物的线粒体DNA，叶绿体DNA都是环形DNA多数DNA是双链的，少数DNA是单链的DNA的一级结构：构成DNA的脱氧核苷酸按照一定的排列顺序而形成的线性结构，即组成DNA的核苷酸的排列顺序。基因：DNA上具有独立功能的基本核苷酸序列单位基因组：一个DNA分子上的全套基因，某一物种的所有基因总和2.2.2DNA的一级结构的测定1.末端终止法FredrickSanger,利用2’3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为DNA合成链延伸的抑制剂，产生长短不一的并具有特定末端的DNA片段。1975年，FredrickSanger,利用DNA聚合酶，建立“加减法”，测定了第一个DNA全序列，即：噬菌体X174（5386bp）2’,3’-ddNTP①将待测DNA加热变性处理成单链，作为合成的模板，并加入与其5’-端互补的短链(RNA引物)作为引物（引物5’端用32P标记）②将样品分为4份，每一份加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）以及一种双脱氧核苷三磷酸（4份样品中分别加入ddATPddGTPddCTPddTTP），并加入DNA聚合酶，催化合成一系列不同长度的片段，每个片段在加入的那种双脱氧核苷三磷酸处终止。③合成产物在同一凝胶上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳中每相差一个核苷酸都可以分离成不同的区带，最后进行放射显影，从电泳图谱上可直接读出其序列。2’,3’-ddNTP3’-ACGTCTGAT-5’dNTPddATPdNTPddGTPdNTPddCTPdNTPddTTPTGCddATGCAGddATGCAGACTddATddGTGCAddGTGddCTGCAGAddCddTTGCAGACddT5’-引物-OH-TGCAGACTA-3’123456789待测链合成链自动测序仪ATCAGACGT5’3’AGCTTGCddATGCAGddATGCAGACTddATddGTGCAddGTGddCTGCAGAddCddTTGCAGACddTdNTPddATPdNTPddGTPdNTPddCTPdNTPddTTP3’-ACGTCTGAT-5’5’-引物-OH-TGCAGACTA-3’待测链合成链2.化学法美国哈佛大学AllanMaxamWalterGilbert利用硫酸二甲酯和肼两种试剂，特异修饰碱基，产生一套长短不一的片段，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射显影，从电泳图谱上读出序列。CH3－O－S－O－CH3||||OO硫酸二甲酯肼硫酸二甲酯可特异修饰G和A（甲基化），但修饰后的G比A其糖苷键更容易断裂。用甲酸代替硫酸二甲酯，则两种碱基都断裂；肼断裂嘧啶核苷酸，但有NaCl存在时，肼专一断裂C，无NaCl,则C和T均断裂。所以不同条件下，可产生以4种碱基为末端的片段。DNA甲酸GA碱基断裂硫酸二甲酯G碱基断裂肼＋NaClC碱裂断裂肼CT碱基断裂①用多核苷酸激酶对待测DNA片段进行末端32P标记，使其带放射性②将样品分成4份，分别加入上述化学试剂(甲酸、硫酸二甲酯、肼＋NaCl、肼)，反应后产生一套片段③反应后将其在同一块凝胶上电泳，电泳完毕后进行放射显影，从电泳图上直接读出序列化学法DNA测序流程硫酸二甲酯甲酸肼肼+NaCl真核细胞DNA一级结构的特点真核细胞染色质由DNA、组蛋白、非组蛋白、RNA等组成