GFP融合蛋白进行蛋白质的亚细胞定位

第三章蛋白质定位的方法第二节利用绿色荧光蛋白融合蛋白法定位蛋白质的方法学生姓名：刘栋导师：陈育新本节课的主要内容蛋白质定位绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白融合蛋白的构建绿色荧光蛋白融合蛋白的检测其它荧光蛋白简介蛋白质定位真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。蛋白质定位蛋白质的亚细胞定位常用方法：蔗糖密度梯度离心；免疫胶体金标记；免疫荧光；与GFP构建融合基因表达融合蛋白；多糖序列分析等。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)2008年诺贝尔化学奖GFP的结构特点GFP的发光机理GFP的荧光特性GFP的优点GFP的改进GFP的应用2008年诺贝尔化学奖日裔美国科学家下村修美国科学家马丁·查尔非美国华裔科学家钱永健诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。2008年诺贝尔化学奖下村修：于1962年在水母Aequoreavictoria发现并分离得到GFP，并发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿色。马丁·查尔菲：证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。钱永健：让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成为现实。GFP的结构特点一级结构GFP由238个氨基酸残基组成,分子量为26.9kDGFP的生色团位于氨基酸序列64~69位GFP的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸，为构成GFP生色团的核心GFP的结构特点空间结构特点：由11条β桶状结构(β-barrel)绕成的一个圆柱体，直径约3nm，长约4nm。一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位置生色团附着在α螺旋上，几乎完美地包埋于圆柱体中心这种方式被称为β罐(β-can)晶体结构GFP的发光机理GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。实质：由第65、66、67位的丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸形成对羟苯甲基咪唑环酮GFP的荧光特性GFP的最大吸收峰为395nm(紫外)，并有一个479nm的副峰(蓝光)；发射光谱最大峰值为509nm(绿光)尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强，因此更适合于活体检测。GFP的荧光特性GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP的荧光特性通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同发射峰和激发峰的突变体，使GFP的荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。项目激发峰发射峰野生型（wt-GFP）红移突变体RSGFP黄绿突变体YGFP蓝色突变体BFP增强型突变体OGFP半衰期短的突变体395471-490513385385488509502-511527445510507GFP及其主要突变体的荧光特征nmGFP的优点易于检测荧光稳定无毒害通用性易于构建载体可进行活细胞定时定位观察易于得到突变体GFP的改进尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但是野生型GFP（wtGFP）具有一定的缺点：GFP有两个激发峰影响了其特异性，并且长波激发峰强度较小，不易观察GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低GFP在某些植物细胞中并不表达GFP的改进除去GFP基因中隐蔽型内含子消除编码蛋白的积累将GFP定位到特定细胞器中改变碱基组分更换GFP生色团氨基酸插入植物内含子增加增强子和更换强启动子GFP的应用蛋白质定位作为报告基因药物筛选融合抗体生物传感器其他方面GFP融合蛋白的构建应用亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞，利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达，最终得到融合蛋白，可以研究目的蛋白的定位。目的基因gfp基因融合基因转化表达检测GFP融合蛋白的构建最关键的就是：要尽可能的不影响目的蛋白的定位和功能。具体蛋白要具体分析。将目的基因与gfp基因融合有以下几种方式:将gfp置于目的基因后面，即目的基因-gfp将gfp置于目的基因前面，即gfp-目的基因。GFP融合蛋白的构建注意事项：两个基因之间用Linker连接。在两个基因交接处可以增加一段核苷酸(3的倍数)，如增加几个为甘氨酸或赖氨酸等编码的三核苷酸。目的是使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较小，有利于GFP发光。前一基因必须要有起始密码，而不能带有终止密码；后一基因要保证有终止密码。构建了融合基因后，必须测序进行验证，确保融合基因读框正确之后才能进行后续研究，以免浪费人力、物力和宝贵的时间。GFP融合蛋白的检测定性检测：可以用常规的落射荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察；定量检测：免疫印迹法酶联免疫吸附法可以在活细胞中进行图像分析，也可以检测固定细胞中的GFP。GFP融合蛋白的检测注意事项：以gfp作为报告基因研究蛋白亚细胞定位，必须做对照。由于某些细胞本身也有自发荧光，必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光，以免假象干扰实验，避免得出错误结论。并不是所有的构建正确的融合基因都能正常表达，因此要尽可能多的获得转基因细胞，如果数目较少，可能会检测不到荧光。其它荧光蛋白简介根据发射光谱，荧光蛋白有以下类型，几乎跨越整个可见光谱。BFPs440–470nmCFPs471–500nmGFPs501–520nmYFPs521–550nmOFPs551–575nmRFPs576–610nmFRFPs611–660nm参考文献[1]崔志芳,邹玉红,季爱云.绿色荧光蛋白研究三个里程碑—2008年诺贝尔化学奖简[J].ChineseJouralofNature,2008,30(6):324—328.[2]徐飞虎,龚兴国.绿色荧光蛋白应用研究进展[J].细胞生物学杂志,2002,24(6):332—334.[3]岳莉莉,齐义鹏.绿色荧光蛋白—现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记物[J].生物工程进展,1997,17(4):40—45[4]张敬之,郭歆冰,谢书阳等.用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠[J].自然科学,2006,16(5):571—577[5]ElenaPopova,BritRentzsch,MichaelBader.GenerationandcharacterizationofaGFPtransgenicratlineforembryologicalresearch[J].2008,17:955–963[6]夏玉凤.以gfp为报告基因研究蛋白亚细胞定位[J].生物技术通报,2006,2:11-13[7]胡建广,尹艳.GFP与微管结合蛋白和肌动蛋白结合区融合蛋白载体构建与表达[J].2004,24(1):53-56That’sall!Thankyou!