Axygen-RNA提取试剂盒

07/1Ver.1Page1AxyPrep总RNA小量制备试剂盒本试剂盒用于从各种动物组织、植物组织、细胞、细菌、酵母和丝状真菌中提取总RNA。提取的总RNA分子完整、纯度高，适用于NorthernBlot、RT-PCR、体外翻译、PrimerExtension、S1核酸酶作图、RNase保护测定、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。一、试剂盒组成、贮存、稳定性Cat.No.AP-MN-MS-RNA-4AP-MN-MS-RNA-50AP-MN-MS-RNA-250Kitsize4preps50preps250prepsSpin/vacminicolumn4502502mlMicrofugetube4502501.5mlMicrofugetube8100500BufferR-Ⅰ3ml25ml125mlBufferR-Ⅱ1ml10ml50mlBufferW1Aconcentrate2.4ml24ml120mlBufferW2concentrate2.4ml24ml2×72mlBufferTE1ml6ml30mlProtocolmanual111Spin/vacminicolumn：小量制备管。BufferR-Ⅰ：细胞裂解液。室温密闭贮存。BufferR-Ⅱ：中和液。室温密闭贮存。BufferW1Aconcentrate：洗涤液。使用前，根据瓶上指定的体积加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用无水乙醇或95%乙醇。BufferW2concentrate：去盐液。使用前，根据瓶上指定的体积加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用无水乙醇或95%乙醇。BufferTE：洗脱液。10mMTris-HCl，0.1mMEDTA，pH7.5。室温密闭贮存。二、注意事项BufferR-Ⅰ和BufferW1A含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。三、实验准备1.第一次使用时，在BufferW1Aconcentrate和BufferW2concentrate中按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇或95%乙醇。2.所有试剂用DEPC处理过的溶剂配制。请选用RNase-free枪头和离心管，以避免提取过程中RNA被RNase降解。07/1Ver.1Page2四、操作步骤不同的样品提取总RNA的操作中略有区别，具体步骤分述如下：【从动物组织中提取总RNA】1.取20-40mg组织，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。*请按下面说明使用组织的量：RNA丰富的组织(如肝脏)不超过30mgRNA含量低的组织(如肌肉)不超过100mg当使用的组织量小于20mg时R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量都减半当使用的组织量大于40mg时R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量按比例增加2.加入400μlBufferR-Ⅰ，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管（试剂盒内提供）中。3.加入150μlBufferR-Ⅱ，漩涡振荡15-30s，12,000×g离心5min。*建议在4℃下离心。4.取上清至1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，混和均匀。步骤5-10可选择离心法或负压法A．离心法5A.将制备管置于2ml离心管（试剂盒内提供）中，转移步骤4中的混合液到制备管中，6,000×g离心1min。*建议在4℃下离心。6A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入500μlBufferW1A，12,000×g离心1min。*确认在BufferW1Aconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。7A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700μlBufferW2，12,000×g离心1min；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。8A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12,000×g离心1min。9A.将制备管放入一干净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加70-100μlBufferTE或RNase-free水。10A.室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA。07/1Ver.1Page3B．负压法5B.将制备管插到负压装置的插口上，将步骤4中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，吸尽管中溶液。6B.保持负压，加入500μlBufferW1A，吸尽管中溶液。*确认在BufferW1Aconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。7B.保持负压，沿管壁四周加入700μlBufferW2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。8B.将制备管置于一个2ml离心管（试剂盒内提供）中，12,000×g离心1min。9B.将制备管放入一干净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加70-100μlBufferTE或RNase-free水。10B.室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA。【从植物组织中提取总RNA】1.取30-150mg组织，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。*请按下面说明使用组织的量：植物叶子通常用量10-80mg植物纤维组织通常用量100-150mg当植物叶组织量小于30mg时R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量都减半当植物叶组织量大于80mg时R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量按比例增加当植物纤维组织量大于150mg时R-Ⅰ，R-Ⅱ和异丙醇的使用量按比例增加2.加入400μlBufferR-Ⅰ，用装有18-23号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管（试剂盒内提供）中。3.加入150μlBufferR-Ⅱ，漩涡振荡15-30s，12,000×g离心5min。*建议在4℃下离心。4.取上清至1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，混和均匀。步骤5-10可选择离心法或负压法A．离心法5A.将制备管置于2ml（试剂盒内提供）离心管中，转移步骤4中的混合液到制备管中，6,000×g离心1min。*建议在4℃下离心。07/1Ver.1Page46A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入500μlBufferW1A，12,000×g离心1min。*确认在BufferW1Aconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。7A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700μlBufferW2，12,000×g离心1min；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。8A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12,000×g离心1min。9A.将制备管放入一干净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加70-100μlBufferTE或RNase-free水。10A.室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA。B．负压法5B.将制备管插到负压装置的插口上，将步骤4中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，吸尽管中溶液。6B.保持负压，加入500μlBufferW1A，吸尽管中溶液。*确认在BufferW1Aconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。7B.保持负压，沿管壁四周加入700μlBufferW2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。8B.将制备管置于一个2ml离心管（试剂盒内提供）中，12,000×g离心1min。9B.将制备管放入一干净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加70-100μlBufferTE或RNase-free水。10B．室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA。【从细胞中提取总RNA】步骤1-4根据细胞培养的方式不同可以选择a或b两种实验方法a.悬浮培养的动物细胞或从培养皿、培养瓶中获得的细胞悬浮液或新鲜分离的动物组织单细胞悬浮液：1a.收集2×106-1×107的细胞，2,000×g离心5min，弃上清。2a.加入400μlBufferR-Ⅰ，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管（试剂盒内提供）中。3a.加入150μlBufferR-Ⅱ，漩涡振荡15-30s，12,000×g离心5min。*建议在4℃下离心。4a.取上清至1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，混和均匀。07/1Ver.1Page5b.96-孔,24-孔,12-孔,或6-孔培养板上贴壁培养的细胞：1b.从96-孔，24-孔，12-孔或6-孔培养板里收集细胞，尽量弃去培养基，每孔加入300μlBufferR-Ⅰ，用移液枪上下吹打8-10次。2b.转移上述细胞悬浮液到1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次。3b.加入110μlBufferR-Ⅱ，漩涡振荡15-30s，12,000×g离心5min。*建议在4℃下离心。4b.取上清至1.5ml离心管中，加入200μl异丙醇，混和均匀。步骤5-10可选择离心法或负压法A．离心法5A.将制备管置于2ml离心管（试剂盒内提供）中，转移步骤4中的混合液到制备管中，6,000×g离心1min。*建议在4℃下离心。6A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入500μlBufferW1A，12,000×g离心1min。*确认在BufferW1Aconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。7A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700μlBufferW2，12,000×g离心1min；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。8A.弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12,000×g离心1min。9A.将制备管放入一干净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加70-100μlBufferTE或RNase-free水。10A.室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA。B．负压法5B.将制备管插到负压装置的插口上，将步骤4中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，吸尽管中溶液。6B.保持负压，加入500μlBufferW1A，吸尽管中溶液。*确认在BufferW1Aconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。7B.保持负压，沿管壁四周加入700μlBufferW2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。07/1Ver.1Page68B.将制备管置于一个2ml离心管（试剂盒内提供）中，12,000×g离心1min。9B.将制备管放入一干净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加70-100μlBufferTE或RNase-free水。10B.室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA。【从细菌中提取总RNA】1.收集0.5-2×109的细菌，6,000×g离心10min，弃上清。用50μlPBS充分悬浮菌体并转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。*请进行细菌计数，对于大肠杆菌而言，1×109/ml细菌的OD600≈1。如果细菌量小于0.5×109，R-I，R-II和异丙醇用量减半。如果细菌量大于2×109，R-I，R-II和异丙醇按比例增加。2.加入400μlBufferR-Ⅰ，用装有