血清总胆固醇测定new

实验五血清总胆固醇的测定（邻苯二甲醛法）生命科学学院杨章民[e-mail]一、实验目的学习分光光度计的原理及操作学习用分光光度法测定血清总胆固醇含量及标准曲线的制作血浆内胆固醇的酯化卵磷脂胆固醇卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（LCAT）胆固醇酯溶血卵磷脂Lecithin-cholesterolAcyltransferase(LCAT)胆固醇的转化（一）转变为胆汁酸初级胆汁酸：在肝脏由胆固醇直接转变生成的胆汁酸。包括游离型和结合型。胆汁酸合成的限速酶是7--羟化酶。次级胆汁酸：初级胆汁酸经胆道系统排入肠道，在肠道细菌作用下的产物。胆汁酸种类游离型结合型初级胆酸甘氨胆酸牛磺胆酸鹅脱氧胆酸甘氨鹅脱氧胆酸牛磺鹅脱氧胆酸次级脱氧胆酸甘氨脱氧胆酸牛磺脱氧胆酸石胆酸甘氨石胆酸牛磺石胆酸HOCOOHOHOHH胆酸3712HOCOOHOHH鹅脱氧胆酸37HOCOOHOHH脱氧胆酸312HOCOOHH石胆酸3HOCONHCH2COOHOHOHH甘氨胆酸3712HOCONHCH2CH2SO3HOHOHH牛磺胆酸3712胆汁酸的肠肝循环胆汁酸排入肠道后，大部分结合胆汁酸在回肠部主动重吸收，其余在各部被动吸收。肠道吸收的胆汁酸经门静脉入肝，肝细胞将重吸收的游离型胆汁酸重新转变为结合型胆汁酸，并与新合成的初级胆汁酸一起再排入肠道，这一过程称为胆汁酸的肠肝循环。胆汁酸的生理作用胆汁酸具有亲水和疏水的两个侧面，是一种很强的乳化剂。功能：促进脂类的消化与吸收；增加胆固醇在胆汁中的溶解度，防止胆固醇析出形成结石。（二）转化为类固醇激素在性腺和肾上腺皮质转变为性激素（睾酮、雌二醇、孕酮）和肾上腺皮质激素（醛固酮、皮质醇、皮质酮）（三）转化为7-脱氢胆固醇胆固醇（肾线粒体）1α-羟化酶7-脱氢胆固醇紫外线VD325-羟化酶（肝微粒体）25-OH-D31,25-(OH)2-D3（皮肤）（活性VitD）（三）脂蛋白的结构血浆脂蛋白中的蛋白质部分称载脂蛋白（apolipoprotein，apo）。①结合和转运脂类，稳定血浆脂蛋白的结构；②调节脂蛋白代谢关键酶的活性；apoAI激活LCAT，促进胆固醇酯化apoAII激活肝脂肪酶（HL）apoCII激活脂蛋白脂肪酶（LPL）③参与识别脂蛋白受体。载脂蛋白及功能小肠食物TG经淋巴入血CEPCAETGCB-48ACETGCB-48ATGCB-48新生CMCMCM残粒HDLapoEapoC、apoA、apoC外周组织LPL脂酸甘油胆固醇脂酸肝HLLRP受体LDL受体CM代谢过程：ECECCEPCATGCTGC新生VLDLVLDLIDLHDLapoEapoC、apoC外周组织LPL脂酸甘油胆固醇脂酸肝HLB-100B-100ETGCB-100CEB-100LDL受体LDLLDL受体代谢过程高脂蛋白血症分型分型脂蛋白变化血脂变化甘油三酯胆固醇ⅠCM↑↑↑↑↑ⅡaLDL↑↑↑ⅡbLDL↑、VLDL↑↑↑↑↑ⅢIDL↑↑↑↑↑ⅣVLDL↑↑↑ⅤVLDL↑、CM↑↑↑↑↑Lecithin-cholesterolAcyltransferase(LCAT)蛋白质胆固醇甘油三酯磷脂(%)游离(%)酯化(%)(%)(%)乳糜微粒(CM)1-21-32-480-953-6VLDL(pre-β）6-104-816-2245-6515-20LDL（β）18-226-845-504-818-24HDL（α）45-553-515-202-726-32脂蛋白的化学组成脂蛋白的功能CM：运输外源性的甘油三酯至全身各组织VLDL：运输内源性的甘油三酯LDL：运输肝脏中的胆固醇酯至周围组织，动脉内膜下积累HDL：将周围组织的胆固醇运输至肝脏，形成胆汁酸以便清除二.实验原理根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法，称为分光光度法(spectrophotometry)。该法具有一定的灵敏度和准确度，分析方法简便快速，仪器设备也不复杂，故应用很广。原理：在一定范围内，吸光度(OD,A)与光程（液层厚度，b）和溶液浓度(c)的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律(Lambert-Beerlaw)，简称比尔定律，即光的吸收定律。A=OD=-lgT=-lg(I/Io)=abc吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂)的本性和光的波长。1.物质不同，则吸光系数不同，所以吸光系数可作为物质的特性常数。在分光光度法中，常用摩尔吸光系数ε来衡量显色反应的灵敏度，ε值越大，灵敏度越高。2.溶剂不同，其吸光系数亦不同，3.光的波长不同，其吸光系数亦不同。如将不同波长的单色光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度—波长曲线，称为吸收曲线(absorptioncurve)，吸收曲线上有极大值(Max)的部分，称为吸收峰。吸收峰所对应的波长，称为最大吸收波长，以符号λmax表示，这是物质定性的依据之一。4.单色光的纯度也影响吸光系数。单色光越纯，即经单色器分光后的波长范围越窄，其吸光系数越大。定量方法：1.吸光系数法2.标准曲线法不是任何情况下都能适用的。特别是在单色光不纯的情况下，测得的吸光度值可以随所用仪器不同而在一个相当大的幅度内变化不定，若用吸光系数换算成浓度，则将产生很大误差。先配制一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件相同情况下，分别测定其吸光度，然后以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制A—C关系图，在相同条件下测出样品溶液的吸光度，就可以从标准曲线上查出样品溶液的浓度。3.对照法：为什么要设对照标准曲线的制作（1）配置一系列浓度不同的标准溶液。（2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。（3）以标准溶液浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。（4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。AC0AxCx定性方法将一系列不同波长的单色光，照射到含待测组分的溶液，可测得相应的一系列吸光度。如果以吸光度为纵坐标，以波长为横坐标作图，便可得到该待测物质的吸收曲线。由于每一种物质均有其特征的吸收曲线，故可与其标准品比较而定性。但在实际工作中常用λmax和ε来定性，λmax(最灵敏)可从吸收曲线中吸收峰所对应的波长直接找出；消光系数ε通常需配制待测物质三种不同浓度的溶液，于固定光程（1cm）吸收池中，在λmax处分别测定其吸光度，根据A=εbc,即ε=A/bc，计算出ε，将三次结果平均，即得该物质的摩尔吸光系数。二、基本原理胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用，产生紫红色物质，此物质在550nm有最大吸收值，可用比色法测定。胆固醇含量在400mg/100ml（OD0.1-1.0）范围之内与吸光度呈现良好线性关系。本法操作简便，灵敏、稳定。三、试剂1.邻苯二甲醛试剂2.90%醋酸3.混合酸：等体积浓硫酸+等体积90%醋酸4.0.1mg/ml标准胆固醇应用液5.兔血清注意本实验所用的混合酸均为浓酸，使用中一定要注意安全。测定时比色杯中溶液体积不能超过高度的2/3。不能将测定的反应液洒入分光光度计内。若有洒落到桌凳仪器上需立即擦除，以免发生伤害胆固醇、醋酸；混合酸分别用0.5mL、5mL干洁的刻度吸管量取，不要混用。邻苯二甲醛、血清用移液器量取。四、操作步骤五.实验结果六.结果讨论管号01234X(待测样品)醋酸液（毫升）0.40.30.20.100.3标准胆固醇（毫升）00.10.20.30.40.1血清邻苯二甲醛（毫升）0.20.20.20.2.0.20.2混合酸（毫升）444444加毕，混匀，静置10分钟后，以对照管校0于550nm测定吸光值，从标准曲线中查出相应的浓度。结果与讨论１.是否做蛋白沉淀对血清总胆固醇测定结果可能会产生什么影响？２.实验在哪些环节能产生误差？３.还有哪些测定血清胆固醇的方法？