氯离子通道和药物靶标

氯离子通道和药物靶标陈　瑛，苏瑞斌（军事医学科学院毒物药物研究所，北京　１００８５０）摘要：氯离子通道的生物功能非常广泛，如参与上皮细胞内液体分泌、细胞容积调控等。氯离子通道突变可引起多种疾病，如囊性纤维化、黄斑部退化、肌强直等。氯离子通道调节剂的应用也非常广泛，其中γ氨基丁酸Ａ（ＧＡＢＡＡ）受体氯离子通道调节剂已在临床上使用，其他小分子调节剂正在临床前研究或临床试验阶段。本文主要讨论靶向氯离子通道药物的应用前景。关键词：氯离子通道；药物靶标；氯离子通道调节剂中图分类号：Ｒ９６２．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７４０４４０（２００９）０６０４５７０４　收稿日期：２００９０５３１　作者简介：陈　瑛，女，硕士，研究方向：神经药理学，Ｔｅｌ：０１０６６９３０６３５，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]通讯作者：苏瑞斌，男，研究员，研究方向：神经药理学，Ｔｅｌ：０１０６６８２８３４１，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　　氯离子通道在机体正常生理功能和疾病的发生发展过程中有重要作用，但以往在药物发现过程中对氯离子通道的关注较少。氯离子通道突变后能引起多种遗传性疾病，最典型的是囊性纤维化。囊性纤维化的遗传学基础已较明确，但目前对此病仍缺乏有效药物。因此，近来研究人员以氯离子通道为药物靶点开展了广泛的研究。依调控机制将哺乳动物体内的氯离子通道分为５类：囊性纤维化跨膜转导调控因子（ＣＦＴＲ），由ｃＡＭＰ依赖的磷酸化激活；钙离子激活的氯离子通道（ＣａＣＣ）；电压门控性氯离子通道（ＣｌＣ）；配体门控氯离子通道，主要由γ氨基丁酸（ＧＡＢＡ）和甘氨酸激活；容积调控性氯离子通道。１　氯离子通道功能检测为了筛选氯离子通道调节剂和阐明这些调节剂的作用机制，必须建立氯离子通道功能的评价技术。目前常用的检测氯离转换子的方法包括电生理学方法，基于浓度的方法及荧光方法，其中最为实用的是基于卤素敏感的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）突变体的荧光蛋白筛选技术。２　囊性纤维化跨膜转导调节因子ＣＦＴＲ是由环磷酸腺苷激活的氯离子通道，主要存在于呼吸道、肠、胰腺、汗腺管、睾丸和其他涉及液体输送的组织上皮细胞膜。它是ＡＴＰ结合盒（ＡＢＣ）转运体超家族中的一员。ＣＦＴＲ的激活包括多个起调节作用的Ｒ区域的磷酸化、与ＡＴＰ的结合及核苷酸结合部位的水解。早在１９８９年ＣＦＴＲ基因就被证实是囊性纤维化的遗传学基础。囊性纤维化属于常染色体隐性遗传病，ＣＦＴＲ突变导致其功能丧失是该病的致病原因。肠毒素所致分泌性腹泻及常染色体显性多囊性肾病（ＰＫＤ）则与ＣＦＴＲ功能的不当激活相关。恢复突变的ＣＦＴＲ的功能有益于治疗囊性纤维化，而抑制ＣＦＴＲ的功能则有助于后两种疾病的治疗。２１　囊性纤维化跨膜转导调节因子抑制剂通过收集各种小分子化合物的高通量筛选，现已得到两类ＣＦＴＲ抑制剂。第１类包括噻唑啉酮ＣＦＴＲｉｎｈ１７２，该药作用于质膜的细胞质一侧，阻断ＣＦＴＲ氯离子电传导，ＩＣ５０值为－３００ｎｍｏｌ·Ｌ－１。分析显示，其作用机制为非电压门控性，通道平均闭合时间明显延长。第２类是甘氨酸肼类（ＧｌｙＨ１０１）。单通道ＣＦＴＲ的电流变化表明使用ＧｌｙＨ１０１时通道状态快速开放和关闭，同时ＧｌｙＨ１０１的抑制效应依赖于胞外氯离子的浓度，表明ＧｌｙＨ１０１是通过与ＣＦＴＲ胞外孔道结合而起效的。甘氨酸肼类的细胞外作用位点为研发用于治疗腹泻且不易吸收的化合物提供了机会。小分子ＣＦＴＲ抑制剂还可缓解多囊肾的囊肿增大。常染色体显性遗传性多囊肾的病因是ＰＫＤ１与ＰＫＤ２基因相互作用过程中的突变，也是慢性肾功能不全的主要原因。ＣＦＴＲ抑制剂噻唑啉酮和甘氨酸肼类能缓减体内外多囊肾模型的囊肿扩大。２２　囊性纤维化跨膜转导调节因子激活物、增效剂·７５４·国际药学研究杂志　２００９年１２月　第３６卷第６期和校正剂传染性腹泻中，细菌肠毒素过度激活ＣＦＴＲ，进而引起肠液过度分泌，野生型ＣＦＴＲ抑制剂可减少肠液分泌；相反其激活剂则能增加基础肠液分泌，因此在治疗便秘方面有潜在用途。野生型ＣＦＴＲ激活剂的另一个潜在用途是治疗干性角结膜炎（干眼症）。干眼症在老年人中较普遍，是由泪液分泌减少和（或）泪液过度蒸发而引起的泪液膜功能缺陷所致。在眼表皮细胞中，ＣＦＴＲ表达丰富，能促进离子和液体分泌。ＣＦＴＲ可被能提高ｃＡＭＰ的物质如受体Ｇ蛋白腺苷酸环化酶激活剂或磷酸二酯酶抑制剂激活，也能被稳定磷酸化ＣＦＴＲ的物质（磷酸酯酶抑制剂）或直接作用于ＣＦＴＲ的物质（如黄酮）激活。目前已得到一种在纳摩尔剂量即能显效的新型小分子ＣＦＴＲ激活物，能直接作用于ＣＦＴＲ。与从豆腐中发现的具有多种生物活性（包括ＣＦＴＲ激活活性）的天然化合物金雀异黄苷相比，合成的黄酮类似物激活ＣＦＴＲ的能力显著提高。选择性ＣＦＴＲ激活物的作用方式更直接，其作用效果也比全身性的胞内环磷酸腺苷信号系统调节剂更为明显。目前囊性纤维化的治疗手段主要是对症治疗，包括抗生素、黏液溶解素、抗炎药物、高张盐水喷雾和肺移植，而没有针对ＣＦＴＲ功能丧失。对于丧失ＣＦＴＲ正常功能的上皮细胞，能恢复顶膜氯离子通透性的药物疗效可能会更好。诱发囊性纤维化的最普遍的ＣＦＴＲ突变是ΔＦ５０８，这种突变会导致上皮细胞通道蛋白的细胞进程出现缺陷，使通道蛋白停滞在内质网内，降解加速，氯离子通道的门控作用受损，进而使上皮细胞氯离子通透性相对减弱。其他较少见的突变类型包括导致氯离子通道门控缺陷的突变，如Ｇ５５１Ｄ３９和导致ＣＦＴＲ顶端过早切除的突变，如Ｗ１２８２Ｘ４０，在囊性纤维化患者中的发生率均小于５％。值得注意的是，近三分之一的囊性纤维化患者除有ΔＦ５０８突变外，还有等位基因的突变，因此对罕见突变类型有效的药物可能会对超过５％的囊性纤维化患者有效。随着针对囊性纤维化中增强氯离子通道功能的研究进展，提高氯离子通透性将有助于修复诱发肺病的潜在细胞缺陷。３　钙离子激活的氯离子通道ＣａＣＣ广泛表达于哺乳动物细胞，也与多种生理功能相关，如上皮液体分泌、卵细胞受精、嗅觉触觉信号传导、平滑肌收缩以及神经元与心肌兴奋。全细胞电流分析表明，ＣａＣＣ各亚型的共同特征包括细胞膜去极化后细胞缓慢激活、稳态电流的外向调整，以及对碘离子的通透性优于氯离子。单通道分析已发现４种或更多不同种类的ＣａＣＣ亚型，已报道的单通道电导包括从心肌细胞的小于２ｐＳ到呼吸道上皮细胞的５０ｐＳ。ＣａＣＣ的激活机制包括被钙离子直接激活（唾液腺上皮细胞）或通过钙作用于钙调蛋白激酶Ⅱ被激活（肠上皮细胞）。各种刺激均能引起胞内钙离子浓度升高，如拟胆碱药作用于腺上皮细胞促进分泌、芳香剂作用于嗅上皮细胞、疼痛作用于背根神经节神经元等；这些刺激使细胞在三磷酸肌醇信号作用下释放胞内钙，或使钙离子通过电压门控钙离子通道内流，从而使胞内钙浓度升高，继而激活ＣａＣＣ使细胞膜去极化，也可激活钙离子敏感性钾通道使细胞膜超极化。ＣａＣＣ激活后的效应具有细胞特异性，例如作用于上皮细胞会促进氯离子分泌，作用于嗅神经感受器会产生动作电位，促进平滑肌收缩，阻止精子与卵母细胞结合等。在某些细胞如平滑肌细胞中，细胞膜去极化激活钙离子电压门控通道，增加了细胞内钙离子浓度。早在３０年前就明确了ＣａＣＣ的功能特点，但最近才借助潜在基因产物，如ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ（属于钙激活氯离子通道ＣＬＣＡ蛋白家族和ＣｌＣ３），确认了其分子组成。这些基因产物是否为本身就是氯离子通道，或是氯离子通道的调节物，或根本就与氯离子通道无关而倍受争议。目前认为ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ最有可能是ＣａＣＣ调节剂，异源表达、诱变和ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）敲除研究表明，ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ引起钙激活，从而导致氯离子内流。４　电压门控制性氯离子通道从电鳐属石斑鱼电器官分离的ｍＲＮＡ克隆后发现了ＣｌＣ，且已确认细菌的２种ＣｌＣ蛋白晶体结构；此外，根据与原核ＣＩＣ的同源性，已将真核ＣｌＣ非晶体结构制成模型。与早期基于嗜水性分析的模型不同的是，ＣｌＣ蛋白有１８个片段的复杂拓扑结构，其中８个片段为发夹结构且未完全跨膜。真核ＣｌＣ的胞质内Ｃ端包括２个重复的胱硫醚β合酶基元，对蛋白质相互作用和通道活性至关重要；其中１个跨膜区还有１个高度保守的谷氨酸残基，该残基对ＣｌＣ通道和运载体功能起决定作用。４１　ＣｌＣ１·８５４·ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　２００９Ｄｅｃ；３６（６）ＣｌＣ１是电压依赖性氯离子通道，随细胞膜去极化，快速和普通门控通道都被打开。ＣｌＣ１和ＣｌＣ０的中、快速门控受胞外氯离子浓度的影响：氯离子浓度减小１０倍将使电压达到可兴奋状态而引发去极化。ＣｌＣ１表达于肌纤维膜上，对神经分布和肌肉电活动变化很敏感。ＣｌＣ１还与营养不良性肌强直有关，使萎缩性肌强直蛋白激酶（ＤＭＰＫ）改变，从而导致异常的ＲＮＡ结合和ＣｌＣ１功能丧失。４２　ＣｌＣ２ＣｌＣ２是广泛表达且能自行调节的氯离子通道，可被细胞容积增大激活。ＣｌＣ２与细胞容积调整有关，但与容积敏感性氯离子通道的生物学特征不同。ＣｌＣ２可维持ＧＡＢＡ能神经元中较低浓度的氯离子，因此预测敲除ＣｌＣ２可能诱导小鼠患癫痫病。然而，研究发现ＣｌＣ２缺陷小鼠主要表现为视网膜光感受器和睾丸精小管的衰退，可能与视网膜色素上皮细胞和塞特利氏细胞中经皮离子运输障碍有关，但未表现癫痫症状。最近研究显示，ＣｌＣ２敲除成年小鼠脑白质形成海绵状空泡。有数据表明，ＣｌＣ２突变还与人类特发性全身性癫痫有关；然而，离体实验发现癫痫受试者ＣｌＣ２突变后并未改变ＣｌＣ２功能，也未发现癫痫受试者中有同样的氨基酸变化。４３　ＣｌＣＫａ与ＣｌＣＫｂＣｌＣＫａ和ＣｌＣＫｂ是肾脏氯离子通道，分别表达在髓袢升支细段和粗段，为氯离子重吸收提供了跨细胞通路。ＣｌＣＫｂ还在包括远曲小管在内的其他肾脏部位表达，二者均对电压依赖性小。基因突变导致ＣｌＣＫｂ功能丧失会引起３型Ｂａｒｔｔｅｒ′ｓ综合征，特征是ＮａＣｌ重吸收受阻伴低钾血症、低氯血症和碱中毒。ＣｌＣＫ１缺失（类似于人ＣｌＣＫａ）的小鼠表现为尿浓缩功能缺陷所致的肾源性尿崩症。肾性失盐综合征（４型Ｂａｒｔｔｅｒ′ｓ综合征）是由另一种不相关的蛋白ｂａｒｔｔｉｎ突变所致，该蛋白在校正ＣｌＣＫａ和ＣｌＣＫｂ表达方面起作用；Ｂａｒｔｔｉｎ突变者还表现为听觉损伤，原因是影响了内耳耳蜗缘细胞中的ＣｌＣＫａ，ＣｌＣＫｂ和ｂａｒｔｔｉｎ向内淋巴分泌钾离子。ＣｌＣＫａ和ＣｌＣＫｂ均为功能获得性多态变化与高血压发病有关，盐敏感性高血压与ＣｌＣＫａ单个核苷酸的多态变化有关，因此肾ＣｌＣ抑制剂有可能成为新的降压药。４４　细胞内ＣｌＣ细胞内ＣｌＣ突变后致病机制主要涉及胞内细胞器酸化障碍。突变致ＣｌＣ５功能丧失会引起Ｄｅｎｔ病，表现为肾近曲小管胞内受体介导的内吞作用和内涵体酸化障碍引起蛋白尿和肾结石。近曲小管细胞吸收甲状腺激素的能力受损会改变钙平衡且引起尿中磷酸盐过多，从而引起肾结石。突变致ＣｌＣ７功能丧失则能够引起骨质疏松症。４５　抑制剂和潜在药物靶标现有多种低选择性的潜在ＣｌＣ蛋白抑制剂。ＣｌＣ１能被微摩尔浓度的９蒽甲酸（９ＡＣ）和２（ｐ氯苯基）丙酸（ＣＰＰ）类似物抑制；苯并呋喃羧酸能阻断ＣｌＣＫａ和ＣｌＣＫｂ，且半数抑制浓度小于１０μｍｏｌ·Ｌ－１；灭酸酯类如尼氟灭酸在０１～１ｍｍｏｌ·Ｌ－１范围内的作用具有双相性，较低浓度时会使离子流增大约３倍，高浓度时有抑制作用。芳香剂分子各部分二面角的减小可使其抑制作用转换为激活作用，这使得开放ＣｌＣ的药物研发成为可能。野生型ＣｌＣ蛋白可能是潜在的药物靶标。肾ＣｌＣ抑制剂可作为利尿剂用于治疗高血压和充血性心力衰竭。药物选择性作用于ＣｌＣＫａ或ＣｌＣＫｂ可避免听觉损伤；ＣｌＣ７的抑制剂则可降低骨质疏松症中破骨细胞的活性，进而阻止或逆转疾病的发展。５　以配体门控氯离子通道为靶点的调节剂筛选抑制性突触传递与ＧＡＢＡ和甘氨酸受体有关，二者分别在脑和脊髓中发挥重要作用。ＧＡＢＡ