流式细胞术实验技巧及数据分析

流式细胞术实验技巧及数据分析上海交通大学医学院史桂英BD公司不同型号流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto一流式细胞仪的基本原理*稳定流动*激发光斑*荧光补偿*荧光素选择二数据分析及开窗FCM原理示意图层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流的形成要满足雷诺数dρVRe=2300，η式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d和V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦作用,为细胞分析分选提供技术保证.层流技术液流驱动系统（示意图）流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即P=(1/2)V2(忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。低速高速不同样本速率形成的样本流激发光源与光束成形系统.20um64um32um032um聚焦距离激光束聚焦透镜强度光束成形与细胞受照方式这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照FCM的单细胞照明技术荧光光谱重叠FITC和PE荧光光谱重叠UncompensatedvsCompensatedFL1FL2利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”荧光补偿荧光补偿Mean值判断补偿双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE488525、575绿色、橙色FITC+Tred488525绿色568615红色FITC+PeCy5488525、675绿色、红色FITC+ECD488525、625绿色、橙红色F+P+PeCy5488525、575、675绿、橙、红色F+ECD+PeCy5488525、575、675绿、橙红色、红色F+P+PeCy5+APC488525、575绿色、橙色633670红色荧光染料激发波长（nm)发射波长（nm)颜色用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。LaserCY7755PEECD620CY5670488nm能量传递染料：流式细胞术操作流程：培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液制备荧光抗体标记上机检测表型测定细胞分选继续培养FISHPCR统计学分析单分散细胞FSCFSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关SSCSSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关细胞散色光信号细胞荧光测量细胞的自发荧光未经染色的样品细胞在激发光的照射下可测到有微弱的荧光信号.细胞的特异性荧光经过各种特异染色的细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光信号.自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自发荧光信号特异染色的荧光信号DNA分析比较排除双联体细胞细胞阻滞在G2M期双克隆细胞周期分析溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，BrdUrd)是胸苷的一种类似物。它可以替代胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。BrdUrd和DNA双标记染色BrdUrd与PI检测BrdUrd与PI检测BrdUrd与PI检测细胞三色荧光检测细胞因子测定*检测T细胞(CD69)活化G6=R1*R5*CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调细胞因子分析图*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较纯化单核细胞调节性T细胞检测G3=R1*R3G4=R1*R4凋亡细胞测定凋亡细胞测定细胞凋亡检测阴性的设置血小板检测血小板检测血小板检测血小板检测谢谢