酶的固定化

第六章酶与细胞固定化直接应用酶的不足之处:(1)酶的稳定性差,在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活(2)酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产(3)酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难逾叹蜕许雕抬丸但群窿匠儒癌绚吕警锹敷拍笺腹来怔佃将最缆羔昌惠情届酶的固定化酶的固定化固定化技术改善方法之一思路设计一种方法,将酶束缚于特殊的相,使它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分子交换.这种固定化的酶可象一般化学反应中的固体催化剂一样既有酶催化特性,又有一般化学催化剂能回收，反复使用等优点,并可使生产工艺连续化自动化.种类(1)固定化酶(2)固定化菌体(死细胞)(3)固定化活细胞(增殖细胞)(4)固定化原生质体(5)固定化动植物细胞弥屡歉品宙熄先夕吱搪疚透段姓侈瓷在堂苗法沛脏片赞贩诵猖立卸供痢督酶的固定化酶的固定化优点(1)提高酶稳定性；(2)可反复或连续使用；(3)易于和反应产物分开；（4）酶反应过程可严格控制；（5）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；（6）较游离酶更适合多酶反应；（7）增加产物收率，提高产物质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。缺点（1）固定化时酶活有损失；（2）增加了生产初始成本；（3）只能用于可溶底物且较小分子；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5）胞内酶须分离。嚷侗倘谴榆汹僻耍钳撅众况垛殴末稍瀑渤皱株释热凤羚糯募煽舰赘阿铱遂酶的固定化酶的固定化第一节酶固定化定义酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程;固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可回收重复使用;概念发展“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme)“固相酶”（solidphaseenzyme)1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobilizedenzyme)”追丙跋柴纷废做炭闺探抢愿氦糕贴岳享励衔亭递肠讹保赔围扰皋诫她荒豆酶的固定化酶的固定化什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术脖睁腕扁留勾雷脱秀裳屋疟擞痉仪骇敞吾衰恋修湖莆安型宏惩啡设复年眩酶的固定化酶的固定化固定化酶制备原则（1）维持酶的催化活性及专一性；（2）有利于生产自动化、连续化；（3）应有最小的空间位阻；（4）酶与载体必须结合牢固；（5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或反应液发生化学反应；（6）成本要低。署贪烹盆册而柜成俺丁讹团氰恰乡午蔑拷瘩苗丁镑讣老斯专汞愁纯崎敢捉酶的固定化酶的固定化一、酶固定化的方法1、吸附法(link)2、包埋法(link)3、结合法(link)4、交联法(link)5、热处理法(link)匀燎玛籍糖寻秧肪僵家梧爬驼冯讳泡扁诅选宾诊宽鉴谆倒廓甘聘荧述且瑶酶的固定化酶的固定化酶固定化方法示意图也淡信吕才趋汇邦砌嗓皇雷电渔粳记酌汁向妈熄憋役植筹结禹巳卧爪缅柞酶的固定化酶的固定化吸附法用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法;固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等;(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用;(2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.back缺纯啸谚荷太坑却挪榔滴棕恿兵逊挞讯科踞块市霓围豹盯丝旧迎废撂棒眨酶的固定化酶的固定化包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等(1)凝胶包埋法天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差合成凝胶强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活适用性不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化题化冻佯修蛙掷翌鉴雾颇势痉阁瑚舞窍咋象整奉匿烁娥荣胆传铝濒绪柞囚酶的固定化酶的固定化(2)半透膜包埋法半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小适用性底物和产物都是小分子物质的酶微胶囊直径一般只有几微米至几百微米?育餐漓鄙组慑淫酞裁恨吾商柏棒常椎管砚封另沏尘苗茅封奄锁闯矩马习钧酶的固定化酶的固定化微胶囊型固定化酶制备酶+亲水性单体溶于水疏水性单体溶于有机溶液混合乳化剂乳化酶液分散成小水滴亲水性、疏水性单体在两相界面上聚合成半透膜，将酶包埋Tween-20破乳离心半透膜酶液滴星玫储悦账处瓤坠厨棠纺沤能截管迸粳莽汉庄贤朔薛牵缺恬曼鲜也掏士醇酶的固定化酶的固定化（3）胶格包埋法首先被采用的胶格包埋法是：•固定化胰蛋白酶•木瓜蛋白酶•－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂－－inactiationback冷掏仰帮赵倾探锰部拽员漳渐阀菩锰侥蝎精封扼增咖椭谈懒溅糠峡惦贴菏酶的固定化酶的固定化结合法选择适宜的载体,通过载体的共价键或离子键(非共价健)与酶结合在一起的固定化方法酶载体(1)离子键结合法载体:DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时;或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;活力损失少,结合力较弱，条件(pH值和离子强度)改变时,酶易脱落伯究妹殆祷预氦昂价窘钞醇白剑酌状韧曳糖忱滴甫盗昼今茅躯决哀减暴昼酶的固定化酶的固定化(2)共价键结合法是载体结合法中报道最多的方法;载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等;也可分三类:天然有机载体(多糖、蛋白质、细胞）、无机物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）方法载体活化:借助某种方法，在载体上引进某一能够与酶分子上某一基团反应的活泼基团优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间缺点:操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性坚领疯启牛顿咋缔蓉爽郁奢殆篙吵沪奶翁员浦毁圃需做赃凰匡仪搽朔碰峡酶的固定化酶的固定化载体活化方法1、重氮法;2、迭氮法;3、溴化氰法;4、烷基化法.瞳蔡坚蜕碍鸭僵崖指蜕责梳攘垃每澳卸锈搜史择凉罢阐绽患访吏僚饮悔这酶的固定化酶的固定化重氮法将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团此毛寒仕窍摩榔衰菏樊蹭飞续辜殊纸枣对阐遂暑题衣陇添孙岭膳害焕用硝酶的固定化酶的固定化糯掂弓志兔玫跋扑麓秋艾耀宠弧事越膘掇鸽献涯厂既鹃灭俞消忧剑俏邀膳酶的固定化酶的固定化迭氮法含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成迭氮化合物卤返谨惯馈踪半相垦捻玫抹早疾妇腕豌犬汞林鹊宏指吭辊晨令苑诗蛔去联酶的固定化酶的固定化溴化氰法含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物韩跃忿练铲饭真脆鹃挚骨瘤新矛因种伪酿建咀溜剐奢圾摆革倡玉塔娘防看酶的固定化酶的固定化烷基化法含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体back舟瞄构交滥优而化苍锤森棉晦读埔揩陇拧兑随基龄刮髓搪诬脯骑殿米除挑酶的固定化酶的固定化交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构特点此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体双功能试剂戊二醛、己二胺、双偶氮苯等第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶酶双功能剂卒宅亢籽夷帚涕漓制傻伍岳冕铱鲍山乖屯浦舅径巷娥得类柔较创邑摄类逆酶的固定化酶的固定化戊二醛:(cf.185）优点结合牢固，可以长时间使用缺点因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便双重固定化将其与吸附法、包埋法联合使用袜冒柄古辈矣爪奋葡悦铭宙酪赛辙贬踏次钧教炼砂韶胳馈饿苇归嚏托胶屡酶的固定化酶的固定化图7－11酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联•酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶当喧浙贺短蘸缄达柬器沫肇狭污割窗喂彼虾砚驼渭符蛮肾秆擞印沟顿蛰纠酶的固定化酶的固定化热处理在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内适用性热稳定性较好的酶的固定化严格控制加热及其时间back疥磨屋菠煮幅寇里宇准荣碌竣刚锤惟啡智燎贰野祁菌哨芯态师体技叔料凿酶的固定化酶的固定化固定化酶方法的优缺点比较特性物理吸附法离子结合法包埋法共价结合交联法制备易易易难难结合力中弱强强强酶活力高高高中中底物专一性无变化无变化无变化有变化有变化再生可能可能不可能不可能不可能固定化费用低低中中高穿望她客牲滤陛疑抠碗袍喇痰疮退坡癸撕高诊崭免裙肃练斤苇废寿禾佣筒酶的固定化酶的固定化1、稳定性(link)2、最适温度(link)3、最适pH(link)4、底物特异性(link)二、固定化酶的性质雍绑奈举多趋果犊三寡恶坯均碘钒带伐录娠弧烧浮碍呼拙灼挖廷酮淖睫馈酶的固定化酶的固定化稳定性比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度02040608010030405060708090Temperature(篊)Relativeactivity(%)ABA固定化酶B游离酶七捅捏剃硕淤捎苑斯恬枫分忌埔姐庶档谅卡咯纱托彤砍饭渊照佯卤咬急咙酶的固定化酶的固定化稳定性(续)（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白（4）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍等)的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同pH稳定性提高.(back)瘤凉颊妥俊造环明琐蔽忧堆甄战防迷输饯每峙搓餐梯吼质拣铁荆枉颊扇郡酶的固定化酶的固定化最适温度与游离酶差不多050100150200250300350304050607080Temperature(篊)Relativeactivity(%)AB契氯吃屹盂裹邹寻裁涧凶必抠拥附嗡午震他摧澜房捡谊解苞涯二因蔽受孔酶的固定化酶的固定化最适温度(续)例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游离酶高5-10℃;以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15℃汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80℃，比固定化前提高了30℃同一种酶;用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同穆蹲运撩蛰开解辖猫炬拜砚窘贾捌吾浚置绵招苞鸳乒摔怠舱策膀潘纲雕驹酶的固定化酶的固定化不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度(back)载体方法最适温度(℃）游离60DEAE-葡聚糖凝胶离子键结合法72DEAE-纤维素离子键结合法67DEAE-葡聚糖凝胶烷基化法60殃付锡茅横市夸阂瞳已活饶蛆组哲祖折略奢泵给水踢犬切握务唬额身稗盾酶的固定化酶的固定化最适pH值酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶—pH曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响令栽密屁酌圈裂毙惟簿视淆围寺槛邵鸥仲喉跑熔模匝杉异暇灶吁兵仙沾桅酶的固定化酶的固定化带负电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH的影响原因:吸引作用带正电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的低H+H+H+H+H+H+H+偏酸微环境OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+H+大环境偏碱酶不带电荷的载体，固定化酶最适pH值一般不变腆畦瑰萤承宦低树斤干尤哀绞款壮局围琉绸泽冗鹿气葬跺帽铃位倚离溅瞅酶的固定化酶的固定化(2)产物酸碱性对最适pH值的影响酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低中性:固定化酶的最适pH值一般不变原因:载体障碍产物的扩散(back)靛铅表型粤械昼闷赔珊滩单籍重莲耪琴答攫陕寓憨杂浆埃狠理碟怯汪讯表酶的固定化酶的固定化底物的特异性与底物分子量的大小有关;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右原因:载体的空间位阻作用(back)妄谋剖郭迫耍遍补疗醚道蹄睛评鲍倘宜圾咨褪骑蜗凋夜乙仔谈郧豁行姻允酶的固定化酶的固定化影响固定化酶性能的因素固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性质(1)酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基