酶的提取与分离纯化

第六章酶的提取和分离纯化1、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法GoGoGoGo5、酶的组合分离纯化策略Go6、酶的浓缩、干燥与结晶Go第一节酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crudeprotein):采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用各钟柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。酶分离纯化不同阶段本章目录第二节：细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理本章目录进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。1.珠磨法（Beadmill）原理：实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国Microfluidics公司均有产品出售）。2.高压匀浆法（High-pressurehomogenization）——大规模细胞破碎的常用方法利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。原理：在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）不宜采用高压匀浆法。在15-25kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitationphenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。3.超声破碎法（Ultrasonication）一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，该法在实验室小规模细胞破碎中常用。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。4.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等溶菌酶主要用于细菌类细胞壁溶解酶是几种酶的复合物对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。（2）自溶法（Autolysis）某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。4.化学渗透法（Chemicalpermeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。如TritonX-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。（1）表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。（2）EDTA螯合剂能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。（3）有机溶剂（4）变性剂盐酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：缺点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。5.其他方法1.X-press法将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。2.渗透压法（Osmoticpressure）将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。3.反复冻结-融化法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。4.干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。1.破碎率的测定1)直接测定法2)目的产物测定法3)导电率测定法采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。细胞破碎与固液分离紧密相关。2.破碎技术的研究方向1)多种破碎方法相结合2)与上游过程相结合3)与下游工程相结合化学法、酶法、机械法相结合。如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。此外，用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。定义：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。原则：酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。第三节酶的提取酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶本章目录大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。+=-+=-■盐溶液提取（盐溶Salting-in）：Ionicstrength溶解度+-NaClNaClKCl--------------------++++++++++++++++++++分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。■酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，易用酸溶液提取。注意事项：pH值不能过低，以免使酶变性失活。■碱溶液提取有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，应采用碱溶液提取。注意事项：pH值不能过高，以免使酶变性失活。■有机溶液提取有些酶与脂质物质结合牢固，或含有较多的非极性集团，可以采用与水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。注意事项：pH值不能过低，以免使酶变性失活。影响酶提取的主要因素☆温度在适当的范围内，提高温度可以加快酶的提取；☆pH避免在等电点；☆提取液的体积增加提取液的用量，可以提高酶的提取率；但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步分离纯化不利第四节酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4