注射用尤瑞克林的药理学研究脑功能保护作用

注射用尤瑞克林的药理学研究：脑功能保护作用注射用尤瑞克林药理学研究：脑功能保护作用长野弘等前言目前，由猪胰脏提取的激肽原酶（kallidinogenase）制剂已被用于治疗脑血管障碍、血栓性闭塞性脉管炎、高血压及视网膜循环障碍等疾病。但由于其抗原性、免疫性的问题，只限于口服制剂。而从人尿中提取的激肽原酶，在人体没有发现抗原性，并且由于它的速效性以及确切的药效，因此可作为注射剂，其临床应用受到极大关注。但尤瑞克林在实验性脑梗塞模型中，对血流动力学和脑电波活动以及脑梗塞区的影响几乎没有报道。因此，我们进行了尤瑞克林注射剂的应用研究，用兔子制作各种脑缺血模型，观察了尤瑞克林对脑局部血流量、脑电波活动以及大脑皮层氧分压的作用，并由此得出了几个重要结论。实验部分1．实验动物：雌雄兔（来自井上实验动物）在室温23±2℃，湿度55±10％条件下饲养，自由给予食物以及自来水，饲养一周，用作实验。2．试验药物及给药方法；尤瑞克林用0.05M磷酸缓冲液稀释，对照组为磷酸缓冲液。尤瑞克林用微量泵以0.11ml/min的速度持续静注30min。尤瑞克林是由238个氨基酸组成的酸性糖蛋白。其活性单位定义为：1PNAU是指在37.0℃、PH8.0的条件下，以H-D-Val-Leu-Arg-p-nitroaniline作为底物，1min水解释放出1μmol对硝基苯胺所需的酶量。3．实验方法1)脑梗塞模型试验a)脑局部血流量及脑电波活动的测定：用体重3.5kg左右的兔子，每组3-5只。脑梗塞模型制作参照以前的报道。戊巴比妥钠麻醉后，用泮库溴铵松弛。玻璃珠(200-400目，平均直径约50μm)以10mg/只(于20%右旋糖苷溶液中)注入颈内动脉。头部去毛发，沿头皮正中切开，露出头盖骨，在P：1.0、L：5.0的右侧头顶及A：10.0、L：5.0的右侧前头顶上的头盖骨内植入不锈钢电极，测定脑电波。在P：3.0、L：5.0的右侧作一骨窗，将测定H2气体流量用的电极刺入硬1注射用尤瑞克林的药理学研究：脑功能保护作用膜下1mm。假手术组注入20%不含玻璃珠的右旋糖苷溶液1.0ml。在注入玻璃珠15min后，静脉持续注射尤瑞克林，30min。脑局部血流量测定：在气管内插管，通入占吸气量7-10%的氢气。用H2气体流量式组织血流计测定。脑波活动通过安装带夹子的不锈钢螺杆电极，用人力箱记录多种波动描写器系统(RM-6000,日本光电)的同时，用ATAC-450进行周波数解析。在注入玻璃珠前，开始持续静注尤瑞克林15、30min后，及给药完成后30min测定脑局部血流量和脑波活动。b)脑梗灶大小的测定：用体重2.5-3.0kg的兔子，每组2-6只。脑梗塞模型制作参照以前的报道。戊巴比妥钠麻醉后，用泮库溴铵肌松。玻璃珠5mg/只注入，假手术组注入不含玻璃珠的20%右旋糖苷溶液0.5ml。在结扎右颈外动脉后，拔下留置针，缝合筋层和皮层，用青霉素处理。在注入玻璃球24小时后，静脉注入饱和KCL至其死亡，立即取脑。全脑用1%氯沙必利(0.05M磷酸缓冲液溶解)浸渍，37℃，孵化20min。由顶部给整个脑拍照摄像后，用画像解析装置测定底片上没有染色部分的面积，求出大脑皮质梗塞部位的百分率。尤瑞克林在玻璃珠注入5min后，持续30min静脉注入。2)低氧负荷模型试验大脑皮质氧分压的测定：体重3.0kg左右的兔子，每组3-5只。用戊巴比妥钠20mg/kgiv.麻醉后，仰卧固定，剃除颈部的毛，切开气管插入气管针头后，用氯化筒箭毒碱0.5mg/kgiv肌松，立即进行人工呼吸，用脑立体定位装置固定后，剃掉头部的毛，沿头皮正中切开，露出头盖骨，在右头顶部开一骨窗，插入测定氧分压的针式电极。大脑皮质氧分压用PO2测定装置测定。待参数稳定后，将人工呼吸器的气体由室内气体转化成5%O2+95%N2的气体，造成低氧负荷模型。低氧负荷30min后，人工呼吸器内的气体转换为室内气体，然后观察10min。另外，在正常对照组不进行低氧负荷。尤瑞克林的注入是和低氧负荷同时开始，持续静脉注射30min。3)内包破坏模型试验脑波活动的测定：2.8-3.8kg的兔子，每组3-5只，用戊巴比妥钠20mg/kgiv.麻醉后，用脑立体定位装置固定，头部剃毛，沿头皮正中切开，露出头盖骨，制作骨窗，按照Sawyer等的脑图谱，在两侧的内包处插入双电极，用电流刺激装置每隔5分种通60V直流电30秒钟，2次。待电流将内包破坏后，立刻2注射用尤瑞克林的药理学研究：脑功能保护作用拔掉电极，骨窗中塞入骨蜡的同时，涂上牙科用的胶粘剂。然后在P：3.0、L：5.0的位置安装不锈钢电极测定脑电波，最后缝合头皮，给予青霉素处理。另外，在假手术组只在两侧内包刺入电极，但不烧破。手术后7天，用戊巴比妥钠20mg/kgiv.麻醉后，仰卧固定，同前面1）的方法测定脑波并解析。待参数稳定后，持续30min静脉注入尤瑞克林。并且在实验结束后，检查确证所有模型的内包被破坏。4．统计学处理组间的差异检验用student的t检验。结果1．脑梗塞模型组1）尤瑞克林对脑局部血流量及脑电波活动的影响：在模型组中，注入玻璃珠后15-75min内，右侧头顶的脑局部血流量大约下降30-40ml/min/100g(约是注入前的60-80%)，同部位的脑电波大约下降40-50×104的功率（约是注入前的50-70%）。并且，观察到右侧前头部脑电波大约下降25-35×104（约为注入前的60-90%）。与之比较，尤瑞克林治疗组，当注入5.0×10-3PNAU/kg以上剂量时，给药开始后15min及30min对脑局部血流量下降有抑制作用(图1，2)。尤瑞克林对头顶部脑波下降有抑制倾向，在注入5.0×10-3PNAU/kg以上剂量时，对15min的前头部脑波有抑制下降的作用。2）尤瑞克林对脑梗塞灶面积的作用：模型组动物大脑皮质表面约39%是没有染色的部分（梗塞部分），在注入尤瑞克林后，非染色部分下降20%，梗塞部分有所缩小。图3表示代表性例子。2．低氧负荷模型1）尤瑞克林对大脑皮质氧分压的作用：低氧负荷的缺氧对照组兔子的大脑皮质氧分压无论在吸入后15min还是30min，相对于正常对照组都有所下降。与之比较，尤瑞克林治疗组，注入1.25×10-3PNAU/kg时没有观察到影响，但在注入2.5×10-3PNAU/kg以上剂量时，在吸入后15min有抑制大脑皮质氧分压下降的作用。3．内包破坏模型组1）尤瑞克林对脑波活动的作用：两侧内包烧破后7天，对照组的皮质自发脑波比假手术组δ波成分增加，α、β波减少，显示出明显的徐波化。相对于这，注入尤瑞克林5.0×10-3PNAU/kg时，没有影响。注入1.25×10-2PNAU/kg的5、30、45及60min后，δ波成分减少，在注入5、30min中显示θ波成分增加，徐波化改善。3注射用尤瑞克林的药理学研究：脑功能保护作用讨论最初发现激肽原酶对脑循环有作用的是Schneider等的报道，在实验中用热电血流计观察，当狗静脉注入2单位激肽原酶时，脑血流量增加。此外在循环障碍实验观察到在脑动脉硬化患者中，激肽原酶有血管扩张作用。Ishizuka等报道，肌注40单位的激肽原酶能增大脑血流量，引起脑波变化。但尚未有试验性脑梗塞模型中尤瑞克林对血流动力学，脑电波活动及脑梗塞区域作用的综合研究报告。本研究中，我们制作各种脑缺血模型，来研究从人尿中提取的激肽原酶的作用。脑缺血模型制作法：由今本和Kogure等报道，颈内动脉微球体注入制作脑梗塞模型。今本认为用球状的碳微球体时，注入后能比较快到达闭塞部位。我们设计的脑梗塞用玻璃珠形状不规则，表面不光滑，向闭塞部位移动相对缓慢。注入玻璃球后，观察到在脑软膜动脉形成血流障碍。栓塞存在于大脑中动脉或者大脑前动脉的起始部位。通过显微镜观察证实了游走血栓样物质的存在，由玻璃球引起血管障碍会导致血小板机能恶化，促进血栓形成。这些变化酷似人脑血管障碍发生时急性期的变化，表明作者制作的脑梗塞模型是可行的。对于这种脑梗塞模型，注入5.0×10-3PNAU/kg以上尤瑞克林，对玻璃珠注入侧的脑局部血流量及脑波活动的下降有抑制作用。由此认为，在脑梗塞时，尤瑞克林能抑制血流量下降，防止脑机能下降。同时，注入2.5×10-3PNAU/kg尤瑞克林能使脑梗塞面积相对对照组缩小1/2，由4注射用尤瑞克林的药理学研究：脑功能保护作用此证实，尤瑞克林具有防止脑血流量下降，防止梗塞面积扩大的作用。进一步对由吸入5%O2制作的低氧负荷兔子模型的影响研究，结果证实在注入尤瑞克林2.5×10-3PNAU/kg以上量时对大脑皮质氧分压的降低有抑制作用，具有抗低氧负荷的作用。为了了解尤瑞克林对脑出血后的脑机能障碍的作用，通过电流破坏内包，观察在亚急性期脑波活动的变化。注入1.25×10-2PNAU/kg的尤瑞克林对内包破坏后7天亚急性期的皮质自发脑波有明显改善慢波化作用。尤瑞克林对正常时的脑波活动和脑波觉醒反应没有影响。安原等10）报道，胞二磷胆碱能促进脑干网状体的自发单位放电，永井等报道了头盖内压亢进时，脑干部血流增加。如前所述，危机状态时，胞二磷胆碱下降，选择使脑干部血流增加，从活化脑波认为，尤瑞克林对神经回路没有影响，通过改善破坏区域周边的血流下降及与之相伴随的代谢活动下降而间接改善残存的上行性活化系统。由离体狗血管试验证实，激肽原酶使血流增加的作用主要是通过产生激肽，最终由血管内皮细胞释放的血管舒张因子（EDRF）引起。激肽酶需要最适PH值为中性，EDRF在强酸条件下极稳定，因此在呈酸性的缺血组织中，激肽和EDRF的半衰期延长，尤瑞克林的作用更强、更持久。缺血—再灌注后的细胞内钙离子急剧上升，主要是兴奋性氨基酸的参与。我们的脑梗塞模型中，没有缺血再灌注模型，在本模型中关于兴奋性氨基酸是否参与并不清楚。尤瑞克林是高分子蛋白质，通常不能通过血脑屏障，另认为激肽的水溶性高，在脑内移动很困难。所以，很难认为是尤瑞克林的直接效果，但是，尤瑞克林有间接缺血防御效果，使这些因子受5注射用尤瑞克林的药理学研究：脑功能保护作用到影响。由以上结果，尤瑞克林无论对脑梗塞模型、低氧负荷模型及内包电流烧破模型，都有改善病态的作用，明显具有防止缺血、脑机能障碍的发生和发展，保护脑机能的作用。参考文献：1)H.Nagano,T.Auzuki,M.Hayashi.M.Asano,Angiology.43.678(1992).2)E.K.Frey,Arch.Klin.Chir.,142,663(1926).3)D.S.Schneider,Arch.Klin.Chir.,194,373(1939).4)東健一郎，波多野光紀，高尾恭男，新藥と臨床，16，127（1967）.5)Y.Iahiuka.H.Fukuzawa.T.Asada,T,Kariya,Adv,Exp,Med,Biol.,247B.601(1989).6)今本哲治，脈管學。9.103(1979).7)K.Kogure,R.Busto,P.Scheinberg,Brain.97,103(1974).8)時實利彥，藤森聞一，島蘭安雄，佐野圭司，“新腦波入門，＂第2版，南山堂，東京，1970，pp.20—26.9)H.Nagano,T.Auzuki,M.Hayashi.M.Asano,InVitro,7,117(1993).10)安原基弘，“ニコリン文獻集，＂武田藥品編，1969，p.1.11)永井肇，阪野公一，瀨口喬士，藥理と治療,4（1976）.12)鈴木常正，廣岡清隆，吉本信彥，中村繁良，友栗徹士，林元英，應用藥理，45，367（1993）.13)鈴木常正，友栗徹士，林元英，應用藥理，45，375（1993）.14)J.J.Murray.I.Fridovich.R.G.Makhoul.P.Hagen,Biochem.Biophysic,Resear,Communications.,141,689(1986).6