蛋白质盐析

一、盐析盐析：溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化，可复原。（一）基本原理蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等参数的影响。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，表面：大部分是亲水基团内部：大部分是疏水基团蛋白质呈稳定的分散状态两性物质，一定pH下表面带有一定的电荷，静电斥力作用使分子间相互排斥蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成水化膜，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。当向蛋白质溶液中加入中性盐时：低盐--盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大)高盐--盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小)盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间排斥作用减弱中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化作用从而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域H+OH-+++++++++++pHpI,带正电，有水膜，是稳定的亲水胶体_________pHpI,带负电，有水膜，是稳定的亲水胶体_+++++____pH=pI时,有水膜，是不稳定的亲水胶体中性盐破坏水膜+++++++++++中性盐破坏水膜_+++++____中性盐破坏水膜_________中性盐中和电荷SO42-中性盐中和电荷NH4+或Na+蛋白质的盐析机制示意图蛋白质沉淀蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更显著。通常用离子强度表示对盐析的影响。1234561.02.52.00.5-0.5-1.0-1.501.5碳氧血红蛋白的lgS与(NH4)2SO4离子强度μ的关系S0βμ(离子强度)lgS盐析盐溶盐析区:lgS=β-Ksμ蛋白质溶解度常数盐析常数盐离子强度蛋白质溶解度起始蛋白浓度（二）无机盐的选择在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4,Na2SO4，MgSO4，NaH2PO4，NaCl，Na3PO4,K3PO4。(NH4)2SO4原因廉价在水中溶解度大，且溶解度随温度变化小，低温下仍具有较大的溶解度对大多数蛋白质的活力无损害020406080100中性盐温度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.675.481.088.095.31034.918.948.345.343.342.2--34.544.454.663.670.81.67.854.182.693.8101常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水）盐析效果：阴离子阳离子尤其以高价阴离子更为明显。常见阴离子的盐析作用顺序：PO43-SO42-CH3COOClNO3ClO4ISCN阳离子对盐析效果的影响：Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+无机盐可按两种方式加入溶液中：直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产(分批加入，充分搅拌)加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产(防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释)（三）影响盐析的各种因素无机盐的加入量蛋白质的浓度温度pH操作方式1.无机盐加入量的影响1234561.02.52.00.5-0.5-1.0-1.501.5S0βμ(离子强度)lgS盐析蛋白质溶解度0246810-0.500.50-1.00μ(离子强度)lgS蛋白质溶解度0不同蛋白质溶解度与离子强度的关系蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。30lgS蛋白质溶解度2030405060702040100P—不同(NH4)2SO4饱和度C0蛋白质沉淀的速度可用-—对盐饱和度（P）作图来表示：dSdP62030405060704820dSdP–—蛋白质溶解度随(NH4)2SO4饱和度而变化的速率P利用不同蛋白质盐析分布曲线在横轴上的位置不同，可采取先后加入不同量无机盐的办法来分级沉淀蛋白质。2.蛋白质浓度的影响蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。随浓度提高，盐用量减少。640506070804820dSdP–—P不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线3g/L30g/L分级沉淀：将溶液稀释，使重叠曲线拉开距离制取成品：提高蛋白质浓度3.温度的影响低盐浓度：温度升高，溶解度升高高盐浓度：温度升高，溶解度降低温度适当提高有利于蛋白质沉淀。高温容易导致蛋白质变性。蛋白质盐析一般在室温下进行，某些温度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。4.pH的影响蛋白质在pI时的溶解度最小，最容易从溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质的pI附近。耗盐少，蛋白质收率也高5.操作方式的影响10506070饱和度（%）52.51酶活性U/ml操作方式对延胡索酸酶盐析的影响固体，间歇12h饱和溶液，间歇12h饱和溶液，连续12h饱和溶液，连续1.6min采用间歇方式所需盐量比连续方式少；间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。6.盐析法的优缺点（1）优点：①室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活；②非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；③适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用④设备简单，操作方便。（2）缺点：①沉淀物中含有大量盐析剂②硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。