肿瘤研究方法-Approaches and Techniques

ApproachesandTechniquesinResearchonTumorAcourseforPh.D.candidates肿瘤的实验动物和细胞研究技术Theanimalmodelandinvitroresearchoftumor常用研究方式：InVitro:体外研究，细胞、组织培养下进行InVivo:体内研究，人类疾病的动物模型ExVivo:细胞经体外实验处理后，再回输到体内体外处理：转染基因或改变环境(用一些因子)使其分化等体外研究(InVitro)原代培养肿瘤细胞:从肿瘤组织中分离得到的细胞在体外成功地进行培养称为原代培养(primaryculture)肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约7～10天传代一次）半年以上,生长稳定,并能保持肿瘤细胞的特性，称为肿瘤细胞系(cellline)肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cellstrain),细胞具有相同的基因型和表型(单克隆)肿瘤细胞株的建立：1、直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养建系和建株;(从自发或诱发瘤)2、从人或动物的移植肿瘤(如人肿瘤裸鼠移植瘤)组织分离培养建系及建株;(从移植瘤)3、用化学或生物(病毒)方法在体外转化正常的人或动物的细胞株而获得肿瘤细胞株。(体外转化)肿瘤细胞株的鉴定：1.有关的原始资料,包括供瘤病人的姓名、年龄、性别、病历号、临床诊断（TNM）、活检病理诊断,手术切除日期、最后病理诊断等2.形态学观察:▲普通倒置相差光镜:活细胞的形态,细胞间桥,分泌颗粒,重叠生长,▲Giemsa染色或H.E.染色的光镜形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系:HeLa:高浓度血清→长梭形;低浓度血清→圆形细胞,排列如鹅卵石路面;▲透射和扫描电镜▲3D组织结构3.核型及染色体观察:整倍体,异倍体,染色体畸变、标记染色体,染色体分带分析,相隔一定时间重复观察数次4.生长特性:分裂指数（[3H]-thymidine或5-BrdU的labelingindex）、生长曲线、细胞群体倍增时间、集落形成或贴壁率（platingefficiency）半固体培养介质中的集落形成率5.组织特性的鉴定:免疫细胞化学方法上皮性肿瘤标志:CK、上皮膜抗原（EMA）、癌胚抗原（CEA）;淋巴瘤抗原标志:人白细胞分化抗原簇（CD）,有274个以上,T淋巴细胞:UCHL-1(CD45RO),B淋巴细胞:L26（CD20）,软组织肿瘤标志：波形蛋白（Vm）肌源性：结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白神经源性：神经微丝（NF）、S-100蛋白、Leu-7、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白(MBP)组织细胞源性：α-1抗胰蛋白酶、α-1抗糜蛋白酶、CD68血管源性：八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素(UL)基膜源性：纤连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN）体外培养时肿瘤细胞株有可能会失去原本表达的某些组织抗原,抗原标志要多选用几种抗体,以减少假阴性结果;6.其他特性：(a)分泌激素和异位激素:绒毛膜癌→HCG垂体瘤→生长激素肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌→ACTH人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）→促性腺激素肝癌→HCG(b)肿瘤细胞的受体表达:ERPRAR(c)酶及同工酶活性:酶活性保持(HTC→酪氨酸氨基转移酶)、变化诱导剂糖皮质激素、多肽激素改变培养条件：谷氨酸替代谷氨酰胺→脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶活性增7倍左右特异的同工酶谱：绒癌T3M-3表达胎盘性碱性磷酸酶(d)癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：高转移人卵巢细胞系HO-8910PM表达：p53p16bcl-2nm-23CD44v6c-erbB-2EGFR等基因的蛋白产物不表达：Bax基因的蛋白产物7.细胞株交叉污染的检测：细胞遗传学方法：染色体分析特异的染色体标志探针作FISHG带核型分析鉴别同种肿瘤细胞Q带分析检测人Y染色体免疫学方法：HLA或动物的组织相容性抗原的测定生化方法：同工酶谱或其它生化指标8.微生物污染的检测：细菌：培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体真菌：培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子病毒：病毒核酸和蛋白产物支原体：以核酸（DNA）荧光染色即H-stain(Hoechst33258，即二苯并咪唑染色)较为常用,356nm光的激发下可发出458nm的强荧光,体外正常细胞恶性转化的鉴定正常细胞体外恶性转化的鉴定指标(14项指标)（第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过）▲核型分析出现非整倍体▲能在软琼脂培养基中增殖并形成集落▲异种动物接种能生成肿瘤▲端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高指标正常细胞转化的纤维母细胞转化的上皮细胞形态伸展良好,折光较弱;核质比小,梭形,伸展较差,折光较强;核质比大,与正常细胞之间差别不如纤维母细胞胞质嗜碱性弱;核仁较小较少;胞质嗜碱性强,核仁较大较多;多核巨细胞大;多形性较常见多核巨细胞较少较多粘附性细胞间粘附性较强,紧贴瓶壁生长粘附性差,易脱落差别不明显生长特性排列有方向性,单层生长,存在密度方向性消失,多层重叠,密度依赖性抑制消失差别不明显,某些细胞株呈重叠生长依赖性抑制对血清的依赖较高较低差别不明显扫描电镜观察微绒毛少微绒毛丰富微绒毛不稳定,有时增多植物凝集素引起的凝集弱较弱较强细胞表面的糖蛋白和糖脂正常糖基化不完全糖基化不完全纤维连接蛋白正常存在减少或消失纤溶酶原激活酶较低增高不稳定,某些株增高胞质中微丝微管的排列规则紊乱不稳定胞质cAMP浓度较高较低核型二倍体非整倍体或假二倍体非整倍体琼脂培养不生长生长生长接种异种易感动物不长肿瘤长肿瘤长肿瘤世界各国的细胞库（cellbank）及索引美国美国典型培养细胞库（AmericanTypeCultureCollection,即ATCC,Rockville,MD）人与动物细胞培养目录（CatalogofHumanandOtherAnimalCellCultures,NavalBiosciencesLaboratory,CellCultureDepartment,NavalSupplyCenter,Oakland,CA)人基因突变细胞及老年细胞培养库（HumanGeneticMutantCellCultureandAgeingCell,CultureRepositories,InstituteforMedicalResearch,Camden,NJ)欧洲真核细胞培养库(CulturedeCellulesEucaryotes,RepertoiredesUtilisateurs.,M.Adophe,D.Gourdji,A.Tixier-Vidal,R.Robineaux,InsermPublications,101RuedeTobiac,75654Paris,Cedex13医学病毒学系（DepartmentofMedicalVirology,InstitutedePasteur,Paris)欧洲动物细胞培养库（EuropeanCollectionforAnimalCellCultures,即ECACC,PHLS/CAMR,Porton,Salisbury,England)欧洲人类基因突变细胞库(EuropeanHumanGeneticMutantCellBank,DepartmentofClinicalGenetics,ErasmusUniversity,Rotterdam)日本癌细胞系库(CollectionofCancerCelllines,NationalInstituteofHygenicSciences,Tokyo)普通细胞库(GeneralCellBank,InstituteofPhysicalandChemicalResearchofRIKEN,Saitama)FlowLaboratories;GIBCO特殊表型肿瘤细胞系（株）：高转移人肝细胞性肝癌细胞株MHCC97人黑色素瘤细胞株MV3、卵巢癌细胞株HO-8910PM、肺巨细胞癌细胞株PGBE1高度耐药人红白血病细胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增114.7倍分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子人肺小细胞癌细胞株LU-165→抗利尿激素;人肺腺癌细胞株LC-2/ad→α1-抗胰蛋白酶人红白血病细胞株K562高表达端粒酶体内研究(InVivo)肿瘤动物模型：自发性肿瘤诱发性肿瘤移植性肿瘤.一、自发性肿瘤种系：大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见Sinclair猪到一岁时有85%可发生恶性黑色素瘤品系：C3H小鼠―乳腺癌发病率为97%BALB/c―乳腺癌发病率低AKR小鼠―淋巴细胞性白血病发病率为70%~90%近交系SJL/J小鼠―淋巴瘤(何杰金病)自发率高达91%缺点：发病迟,发病时期不集中,发病率也不稳定二、诱发性肿瘤优点：发生率、发病时间、发生部位及组织学类型均易控制实验结果重复性相对较好1.化学诱癌动物肿瘤模型1775年英国医师Pott扫烟囱阴囊癌1914年,日本学者山极和市川煤焦油皮肤癌1934年Yashida用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功我国从1960年代开始进行化学诱癌动物模型的研究1956年亚硝胺和1961年黄曲霉毒素的致癌作用相继被发现(1)化学致癌物▲诱发时间相对较短▲有剂量-效应关系▲基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性，与生物大分子中富于电子的亲核残基相结合,影响硷基对的正常配位或大分子的结构与功能→正常细胞的癌变.▲直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）常见化学致癌物:1)多环碳氢化合物:25种以上,以煤焦油的主要成分3,4-苯并芘和3-甲基胆蒽的致癌性最强2)氨基偶氮化合物:二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄(奶油黄),3’-甲基-4,4’-二甲基氨基偶氮苯(3’-Me-DAB)3)芳香胺类:苯胺印染工厂吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出联苯胺→膀胱癌2-乙酰氨基芴(2-AAF)4)亚硝胺类:亚硝酸盐+二级胺→亚硝胺类化合物强致癌物致癌谱甚广不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官亲和性对称衍生物如二烷基亚硝胺→肝癌不对称的亚硝胺→食管癌5)霉菌毒素:种类较多首推黄曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉变的花生、玉米及谷物中,6)金属元素:砷、铬、镍、→肺癌镉→前列腺癌.(2)影响化学致癌的因素1)动物方面品系:诱发肝癌时：F-344大鼠对DEN和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高诱发皮肤肿瘤：BALB/c和SENCAR品系小鼠对DMNU、DENU的敏感性大大高于Swiss品系小鼠性别:2AAF诱发肝癌：♂小鼠60%发生肝癌,♀小鼠不敏感.F-344大鼠,♀比♂更敏感年龄:一般而言,动物年龄越小,对化学致癌物越敏感,敏感性：胎鼠新生鼠成年鼠2)化学致癌物方面剂量阈值:启动因子（initiator）不表现明显的剂量阈值促癌因子（promotor）则有剂量阈值一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用,因此仍可表现有剂量阈值如3’-Me-DAB(60ppm)致癌强度:诱发大鼠肝癌总剂量:DAB为1000mg3’-Me-DAB为600mg,2-AAF为250mg,DMN只需100mg;诱癌潜伏期:诱发肝癌：AFB1需时约1年,3’-Me-DAB与2-AAF约半年左右,DEN一般只需3个月;诱癌靶器官:诱癌谱：相对专一，如3’-Me-DAB一般只引起肝癌,较广，如亚硝胺类可诱发多器官肿瘤;化学致癌物的相互作用:多数协同作用而加速致癌,少数会产生拮抗作用.有的化学物质单独使用时本身不致癌,但可增强致癌物作用（促癌物）3)诱癌方案（carcinogenicregimen）和方法半年后12周后喂正常饲料(代表1周)喂含0.06%3’Me-DAB的饲料喂含0.02%2-AAF的饲料部分肝切除苯并蒽(Benzanthracene)直接涂擦皮肤注射至皮下产生皮肤癌产生纤维肉瘤非基因毒致癌物(non-genotoxiccarcinogen)美国公布的301种化合物中,162种可致鼠类肿瘤其中36%不引起细胞DNA的改变44%不引起细胞突变致癌机制？促进细胞增殖