诊断学――临床常见病原体检测

第九章临床常见病原体检测Detectionofclinicalpathogen1、临床各类标本的采集、运送和检查的方法；2、临床常见病原体的种类分布及变迁情况；3、耐药病原体检测的意义。医院感染常见病原体的检查。掌握1、药敏试验的原理和方法2、性传播疾病病原体检查的内容了解熟悉一、临床各类标本的采集运送和检查方法二、病原体耐药性检测三、临床常见病原体检测四、病毒性肝炎检测五、性传播疾病病原体检测六、医院感染常见病原体检测一、临床各类标本的采集运送和检查方法标本采集的基本原则根据病史与临床表现确定标本采集的类型与部位，尽量采集病变明显部位标本。在发病的早期或急性期采集标本，最好在抗生素使用前（如使用过抗生素应在申请单上注明）。采集标本防止污染，并置于无菌容器，加盖密封、立即送检。标本必须贴上标签，与检验申请单同时送检。所有的标本都视为感染性标本，做好安全防护。（一）血液标本的采集血液菌血症、败血症或脓毒血症发热初期发热前2小时发热高峰期成人：10-20婴儿、儿童：524小时内采血2~3次采集频率采血量（ml）采集时间需厌氧同时采集可增加阳性率（二）尿液标本的采集采集量：10-20ml中段尿晨尿注意清洁外生殖器导尿更换新的导尿管穿刺尿考虑厌氧菌感染（四）呼吸道标本类型：鼻咽拭子、痰经气管采集的标本。合格痰标本鳞状上皮≤10/LP。上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑！（五）脑脊液与其它无菌体液采集胸水腹水心包液无菌采集是培养成功的首要因素!脑膜炎奈瑟菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌不耐冷！（六）眼、耳标本采集采样容器：运送拭子眼部标本：亦可在局部麻醉后取角膜刮屑。耳标本：外耳道疖和中耳道炎用拭子采样，鼓膜穿刺亦可用于新生儿和老年人。（七）泌尿生殖道标本采集（七）泌尿生殖道标本采集男性：•尿道口分泌物：性传播性疾病•前列腺液：前列腺炎•尿道拭子：在取材前2小时内不应排尿，用男性采样拭子插入尿道3-4cm，轻轻转动并停留时10-15秒后取出（八）创伤、组织和脓肿标本不同部位采集多份标本采集脓液及病灶深部分泌物无菌干燥注射器抽取取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检。创伤范围大开放性脓肿封闭性脓肿疑为厌氧菌（九）血清•用于检测患者特异性抗原抗体病毒肝炎性抗原抗体检测梅毒、艾滋病病毒抗原抗体检测•血清学试验标本送检•一般要求标本采集后2小时内送达实验室。•血培养标本、脑脊液标本延迟送检不应放4℃保存。•烈性传染病标本需专人护送。可能贴错条形码这样不对，扭着我腰都酸啦！标本的实验室质量评估标准1、标本信息要全。2、仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况下不接收。通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而病毒检测的标本可于4℃存放2～3天。3、检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。4、标本储存、运送方式不当，不予接收。标本的实验室质量评估标准5、明显被污染的标本不予接收。6、标本量明显不足的标本，不予接收。7、同一天申请做同一实验的重复送检标本(血培养除外)，不予接收8、对于烈性传染病标本的采集和运送应严格执行相关规定，要有完善的防护措施，按规定包裹及冷藏，附有详细的采样及送检纪录，由专人护送检查方法（一）直接显微镜检查（二）病原体特异性抗原检查（三）病原体核酸检查（四）病原体的分离培养和鉴定（五）血清学试验（一）直接显微镜检查-不染色标本方法：压滴法、悬滴法、湿片法。意义：是否有生长、活动方式。部分病原体可借此初步诊断，如梅毒螺旋体。（一）直接显微镜检查-染色标本染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。方法：革兰染色、墨汁染色、抗酸染色、荧光染色意义：快速诊断的方法之一革兰染色•阳性：紫色或紫红色•阴性：红色阴性杆菌真菌孢子阳性球菌墨汁染色目的：检查新型隐球菌宽厚荚膜脑脊液标本如不能及时送检，是否可冷藏保存？为什么？（五）脑脊液与其它无菌体液采集胸水腹水心包液无菌采集是培养成功的首要因素!脑膜炎奈瑟菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌不耐冷！抗酸染色阳性：菌体呈红色阴性：菌体呈蓝色主要用于分枝杆菌（结核）、奴卡菌鉴别阳性阴性荧光染色•用形态学和免疫学相结合的方法可特异性地检测某些病原体的存在阴道加德纳菌沙眼衣原体SARS（severeacuterespiratorysyndrome）病原体的确定。电镜检查电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值(二)病原体特异性抗原检查原理：利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原。方法：免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、乳凝集试验、对流免疫电泳不足：标本中如果存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能肯定诊断。(二)病原体特异性抗原检查细菌的血清分型：•检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等（三）病原体核酸的检测意义•灵敏度高，是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。•特异性强，阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。•特别适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物。•适用于核酸变异的病原微生物，如病毒（三）病原体核酸的检测•常用试验方法有：1、聚合酶链式反应PCR（polymerasechainreaction）。2、核酸探针杂交技术3、实时荧光定量PCR（RealtimePCR）4、基因芯片等（三）病原体核酸的检测定量PCR灵敏度高特异性强操作简单肝炎病毒、巨细胞病毒HIV、轮状病毒各种病原菌基因芯片灵敏度高特异性强高通量多样本多微生物同时检测核酸探针杂交技术灵敏度不够细菌和病毒1.细菌分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤，标本的正确采集尤为重要！（四）病原体的分离培养和鉴定采集合适的标本合适的培养方法/培养基、培养条件菌落特征、生化反应结果和血清学实验进行鉴定（四）病原体的分离培养和鉴定鉴定的方法：手工法、仪器法（半自动、全自动、快速质谱仪）全自动细菌鉴定仪质谱仪2.不能人工培养的病原体将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养（四）病原体的分离培养和鉴定（五）血清学试验用已知病原体的抗原检测患者血清中相应抗体以诊断感染性疾病。•人体感染病原体后经过一定时间产生特异性抗体，在体内可维持数月或更长时间。（五）血清学试验•方法：凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、间接免疫荧光、放射免疫、酶联免疫吸附试验。•双份血清检查：病程早期和晚期分别采血清2-3份检查，双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体感染。•单份血清检查：特异性IgM可作为感染性疾病的早期诊断指标，且可区分原发与复发感染。（五）血清学试验适用范围•血清学诊断可用于现症诊断，还可以用于疾病追溯调查。•血清学诊断对于某些病原体不能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据。不适于疾病的早期诊断，因为抗体检出最早也需在感染4-5天以后，2周后效价才逐渐增高（六）细菌毒素检测•内毒素：革兰阴性杆菌死亡或自溶后释放。•外毒素：葡萄球菌肠毒素、肉毒毒素、霍乱肠毒素。方法有生物学法、基因探针技术、免疫血清法、仪器法二、病原菌耐药性检测概念及方法•药物敏感性试验:测定抗感染药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为简称药敏试验。•方法：1、K-B纸片琼脂扩散法2、稀释法3、浓度梯度纸条扩散法4、耐药筛选试验5、折点敏感试验药物敏感试验待检菌生理盐水MH平板药敏试片K-B纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauerdiscagardiffusionmethod）18-24小时培养药物敏感试验稀释法（dilutiontest）琼脂稀释法肉汤稀释法药物敏感试验浓度梯度纸条扩散法(gradientdiffusionmethod)药物敏感试验耐药筛选试验：以单一药物、单一浓度检测细菌耐药性。折点敏感试验：是仅用特定抗生素检测细菌耐药性。药物敏感试验报告方法：•敏感(susceptible，S)S：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。•耐药(resistant，R)R：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。药物敏感试验•中度敏感(intermediate，I)I：测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或在测定药物浓集部位的体液(如尿)中被抑制。•最低抑菌浓度（MinimalinhibitoryncentrationMIC)MIC：够抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为最低抑菌浓度。执行标准均来自临床实验室标准协会（CLSI）（一）概念耐药性（drugresistance）：是指细菌对药物所具有的相对抵抗性。固有耐药性（intrinsicresistance）：是由细菌染色体基因决定而代代相传的耐药，如肠道杆菌对青霉素的耐药。获得耐药性（acquiredresistance）：是细菌与药物反复接触后对药物的敏感性降低或消失，大多由质粒介导其耐药性，但亦可由染色体介导。（二）耐药性病原体1、耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）2.氨基糖苷类抗生素高耐药和耐万古的肠球菌（VRE）3.耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）4、超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌（ESBL）5、多重耐药或泛耐药的铜绿假单胞菌和鲍曼不动相菌6、耐拉米夫定和泛昔洛韦的乙肝病毒。（三）耐药机制1、细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统；2、产生抗生素灭活酶或钝化酶；3、改变药物的作用靶位；4、外膜通透性下降；5、主动外排系统过度表达；6、形成生物膜及外源耐药基因的获得。•细菌的多种耐药基因可协同作用，导致多耐药菌株的出现。（三）耐药机制（四）耐药菌检测的意义耐药菌检测意义耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRSE）对全部β一内酰胺类抗菌药物，包括青霉素族和头孢菌素族对氨基糖甙类、大环内脂类、克林霉素和四环素等抗生素多重耐药。治疗首选药物为万古霉素氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌提示氨基糖苷类细胞壁的抗菌药物如青霉素类合用治疗无效，有助于临床调整和重新确定治疗方案。（四）耐药菌检测的意义耐药菌检测意义耐青霉素的肺炎链球菌肺炎链球菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢克肟、头孢唑啉的临床治疗疗效很差，治疗时参考药敏结果选择药物，经验治疗重症感染时，可用头孢曲松或头孢噻肟联合万古霉素用药。超广谱β-内酰胺酶（大肠、肺克）2010更改部分头孢菌素的折点后，病人的结果不需修改。院内感染控制仍需报告ESBL（四）耐药菌检测的意义耐药菌检测意义β-内酰胺酶1、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以及卡拉莫拉汉菌等阳性，表示对青霉素、氨卞西林以及阿莫西林耐药。2、葡萄球菌属以及肠球菌属等，阳性表示对青霉素、氨基组青霉素、羧基组青霉素以及脲基组青霉素耐药（四）耐药菌检测的意义检出耐药菌需采取的重要措施：接触隔离！！（五）病原体耐药基因检测耐药基因的产生：1、获得外源性基因2、细菌自身基因突变细菌耐药基因检测方法：PCR法、生物芯片、PCR-RFLP分析、动测序、PCR-SSCP分析三、临床常见病原体检测细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体以及立克次体等。（一）细菌感染检查项目的选择细菌感染抗原抗体检测PCR技术基因探针技术培养涂片镜检（二）病毒感染检查项目的选择电镜检查核酸检测（PCR）细胞培养特异性抗体检测（三）真菌感染检查项目的选择真菌培养涂片镜检抗原检测灾光定量PCR核酸杂交技术rDNA序列测序基因组核酸电泳核型分析G试验GM试验（四）寄生虫病病原学诊断免疫学诊断寄生虫DNA探针技术PCR（四）支原体检测支原体肺炎支原体：肺炎解脲支原体、人型支原体：泌尿生殖道感染培养法免疫荧光法光定量PCR和DNA探针技术（六）螺旋体检测•暗视野显微镜检查：梅毒血清学试验（1）过筛试验：RPR、VDRL、TRUST（2）确诊试验：FTA-ABS、MHA-TP、TPPATP-PCR：TP—PCR检测梅毒螺旋体DNA，特异性很强，敏感性很高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。PCR检测梅毒螺旋体的DN