三.HPLC分析方法的建立剖析

第三讲.HPLC分析方法的建立天津市倍思乐色谱技术开发中心BaseLine®一.RPC分析方法建立二.NPC分析方法建立三.GPC分析方法四.HPLC应用实例五.HPLC的定量分析一.反相HPLC（RPC）分析方法的建立建立分析方法的步骤样品信息分析目的要求样品制备选择检测方法和条件选择HPLC方法优化分离条件定性定量分析分析方法验证样品中的化学成分化合物的结构与官能团化合物的分子量化合物的酸碱性和pKa样品适宜的溶剂及溶解度样品各成分的含量范围化合物的紫外吸收光谱样品的组成与性质样品的制备溶剂萃取固相萃取膜分离，超滤，超临界萃取等图1非离子样品的反相分离过程示意图黑点表示在极性流动相和非极性固定相间分配的样品分子极性非极性亲水性0123456789101112131415161718疏水性RPC的保留机理影响RPC的保留的因素：1.流动相的影响：水甲醇乙腈乙醇四氢呋喃丙醇二氯甲烷A+B：水+有机溶剂最佳分离条件：1k102.%B的选择：3.流动相强度：水甲醇乙腈乙醇四氢呋喃丙醇二氯甲烷4.色谱柱和柱温的影响：非极性、非离子化合物的RPC保留值规则：(弱）未键合硅胶≤氰基C1（TMS）C3C4苯基C8≈C18（强）通常柱温增加1℃，K会减少1%-2%反相色谱的选择性：溶剂强度的选择性溶剂类型的选择性柱类型对选择性的影响温度对选择性的影响1.溶剂强度的选择性2.溶剂类型的选择性3.柱类型对选择性的影响4.温度对选择性的影响：反相色谱中分析方法的建立：反相方法建立的推荐步骤：1.调整%B，使0.5k20，（1k10更好）2.检查峰拖尾或塔板数低的现象3.如果必要，调整选择性a.微调%Bb.改变有机溶剂c.混合有机溶剂d.改变柱类型e.改变温度4.优化柱条件（柱长、颗粒尺寸、流速）混合溶剂的使用：柱类型的影响：024681012141626%MeOHC8柱（a）123456723%MeOH苯基柱0214681034561412167212%MeOH氰基柱02146810314121672654+01.02.01234+65752%MeOHC8柱58%MeOH苯基柱0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.8132456+7+0.40.00.20.60.81.052%MeOH苯基柱7+1.61.2311.451.826+(b)60.01.02.033.04.045732%MeOH氰基柱623%MeOH苯基柱26%MeOHC8柱2+10213465810420214681034561412714121672Rs=0.8Rs=2.01Rs=2.0不同溶剂与柱类型的结合使用：正相色谱分析方法的建立1.样品在RPC中不保留（亲水性太强）2.样品在RPC中保留太强（疏水性太强）3.采用RPC分离不能获得足够的峰间距（α=1）4.样品含有空间异构体，立体异构体或非对映异构体5.期望回收到大量疏水性样品组分（制备色谱）6.样品溶于非极性溶剂（若采用RPC柱，会对直接进样造成问题）使用正相色谱（NPC）的理由：正相色谱保留机理正相分析方法建立的推荐方法：1.调整%B，使0.5K20，（氰基柱、己烷-丙醇做流动相）2.检查峰拖尾现象3.如必要，调整选择性a.微调%Bb.改变有机溶剂种类（MC、MTBE、EtAc）；微调%Bc.混合有机溶剂d.改变柱类型（二醇、氨基、硅胶）；微调%B4.优化色谱柱条件（柱长、颗粒大小、流速）NPC溶剂选择性实验的对应色谱图15×0.46cm硅胶柱，流动相如前，2.0ml/min，350C。样品为取代萘混合物，取代基：12-OCH3，21-NO2，31，2-（OCH3）2，41，5-（NO2）2；51-CHO，82-CHO，91-CH2CN，101-OH，111-COCH3，122-COCH3，132-OH。1234567010123458910111213+100121249113101358100124911310135+8100121249113105+813010124311125891013015941110138321012503121011910131284+GPC分析方法SEC保留机理GFC:凝胶过滤色谱水相流动相分离水溶性大分子固定相：多糖型凝胶、多孔交联聚甲基丙稀酸酯类树脂、交联聚乙稀基醇树脂、羟基化聚醚类亲水性树脂等。GPC:凝胶渗透色谱有机相流动相分离脂溶性高分子固定相填料：苯乙烯-二乙烯苯多孔微球系列理想SEC填料的性能要求SEC填料的色谱特征：SEC应用：分离复杂样品，然后再以高分辨率的HPLC分离纯化.分析纯化高分子化合物，以确定单聚、二聚和多聚物.以校正曲线估算大分子物质分子量.实例:凝胶渗透色谱法测定羟乙基淀粉分子量色谱条件:1.色谱仪器：pharmaciaLKBHPLCpump2248KNAUERDifferental-referactometer2.色谱柱：ShodexOHpakSB-804HQ(聚羟甲基丙烯酸酯凝胶)规格：柱名排阻限(Pullulan)粒径(μm)尺寸(mm)SB-804HQ1,000,000108.0x3003.流动相：0.7%硫酸钠+0.02%叠氮化钠4.流速：0.5ml/min5.柱温：35℃实验步骤：1.选用分子量为2000000和180的两种淀粉确定该色谱柱的检测窗口,见图一。图一：分子量为180的淀粉的色谱图tR1:19.673min分子量为2000000的淀粉的谱图tR0:12.902min2.分别以分子量为11800、22800、47300、112000、212000淀粉标准品，其相应的GPC谱图，见图二。图二：分子量为11800淀粉谱图tR2：16.965分子量为22800淀粉谱图tR2：16.230分子量为47300淀粉谱图tR2：15.445分子量为112000淀粉谱图tR2：14.930分子量为2000000淀粉谱图tR2：13.7203.标定曲线的确定淀粉标定曲线y=-2.692x+5.6637R2=0.9989012345600.20.40.60.8(Vr-Vr1)/(V0-Vr1)logM系列1线性(系列1)4.未知淀粉谱图y=-2.692x+5.6637R2=0.9989X=(VR-VR1)/(VR0-VR1)tR1:19.673mintR0:12.902mintR1:14.530计算得：未知淀粉M=29046银杏内酯色谱条件：色谱柱：BaselineC184.6×150mm,5μm流动相：甲醇：水：四氢呋喃=25：65：10流速：1ml/min检测：ELSD,蒸发管温度85℃，气体流速4.0Bar系统评价峰号峰名保留时间/min峰面积mAUs塔板数(N)分离度(Rs)拖尾因子USPTf1银杏内酯A6.247158814.3445146.719/1.1742银杏内酯B7.615402280.1886086.1683.1611.1443白果内酯8.870418603.3446992.2792.6221.0914银杏内酯C11.713330196.2507052.8474.8990.981五种二氢吡啶类药物色谱条件：色谱柱：BaselineC184.6×250mm,5μm流动相：甲醇：水=75:25流速：1ml/min检测：UV237nm系统评价峰号峰名保留时间/min峰面积mAUs塔板数(N)分离度(Rs)拖尾因子USPTf1杂质12.74567928.125/1.8181/2硝苯地平4.927294767.2507041.1491.4751.4153尼群地平8.078648196.7508204.8964.0431.2834尼莫地平9.060810590.8758377.0292.2371.2605非洛地平14.5971114624.25010027.2095.3661.2556拉西地平25.787691817.81310525.8752.9571.229酚咖片色谱条件：色谱柱：BaselineC18,4.6×250mm,5μm流动相：甲醇：水：冰醋酸=32：65：3流速：1ml/min检测：UV275nm酚咖片色谱图（d/qhq/酚咖片/B0029,5.0μl）系统评价峰号峰名保留时间/min峰面积MAUs塔板数(N)分离度(Rs)拖尾因子USPTf1扑热息痛3.812285765.188///2咖啡因6.008183115.5476073.3806.2261.4383阿司匹林14.447180600.40612993.96617.5691.2174苯甲酸20.563475402.96916084.1758.9951.172五.HPLC定量分析方法1.归一化法：以峰面积为基础的归一化法加校正因子的归一化法2.外标法：外标曲线法外标一点法3.内标法：内标曲线法内标一点法内标加校正因子法4.标准加入法1.归一化法：1.1以峰面积为基础的归一化法1.2加校正因子的归一化法相对校正因子：ssiigAmAmf//100%2211nniiifAfAfAfAC2.外标法2.1外标曲线法bCaAsisiiimAAm2.2外标一点法：%4.17%1001255.05010108.6159976704250701%1001255.0501010%66对对供黄芪苷CAA内标法3.1内标曲线法isibCaAA/标标样样＝isisiiCAAAAC)/()/(3.2内标一点法：3.3内标加校正因子法：100%WmfAfACsssiiissiigAmAmf//相对校正因子：例2校正因子法的测定复方炔诺酮片中炔诺酮的含量ODS色谱柱、甲醇－水（60：40）流动相、监测器UV280nm、对硝基甲苯为内标物。（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml容量，进样10ul，记录色谱图。重复3次。测得含0.0733ml/ml内标物、0.600mg/ml炔诺酮和0.035mg/ml炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表。（2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。研细后称取732.8mg（约相当于炔诺酮7.2mg）,用甲醇配制成10ml供试品溶液（含内标物0.0733mg/ml）。测得峰面积列于表。计算炔诺酮的校正因子和复方炔诺酮片中炔诺酮的含量。表复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（μV·S）炔诺酮炔雌醇内标物（对硝基甲苯）对照品溶液1.981×1061.043×1056.587×105供试品溶液2.442×1061.387×1056.841×105炔诺酮的含量为：每片含炔诺酮的量为：60.3×0.97%=0.586（mg/片）72.2)10587.6/(100733.0)10981.1/(10600.0//56iiAmAmf酮酮酮炔诺酮的校正因子：%97.08.732100733.0110841.672.210442.2%56WmfAfACsSS酮酮4.标准加入法riririiiAAAAAAmm/'/'/例3欲测定二甲苯的混合试样中的对－二甲苯的含量，称取该试样110.0mg，加入对－二甲苯的对照品30.0mg，用反相色谱法测定。加入对照品前后的色谱峰面积（mm2）值为，对-二甲苯：A对40.0，A’对104.2；间-二甲苯：A间141.8，A’间156.2。试计算对-二甲苯的百分质量分数。对-二甲苯的质量:mgAAAAAAmmriririii97.218.141/402.156/2.1048.141/400.30/'/'/%0.20%100110/97.21含量