生物技术药物制剂-九江学院

九江学院临床医学院陈绪龙2011年11月4日生物技术药物制剂主要内容概述多肽、蛋白质类药物的注射制剂多肽、蛋白质类药物的非注射制剂第一节概述生物技术或称生物工程（biotechnology)：是应用生物体（包括微生物，动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。现代生物技术：主要包括基因工程，细胞工程与酶工程。此外还有发酵工程（微生物工程）与生化工程。生物技术药物：系指由重组产品、天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物药物的总称。2、现代生物药物的分类(1)基因重组多肽、蛋白质类治疗剂(即重组DNA技术)(2)基因药物(基因治疗剂、基因疫苗、核酸)(3)天然生物药物(动物、植物、微生物和海洋生物药物)(4)合成和部分合成生物药物3、生物技术药物的特点多数受胃酸及消化酶的降解破坏其生物半衰期亦较短，需频繁注射给药即使皮下或肌肉注射，其生物利用度也较低长期注射易造成患者心理和生理的痛苦多数多肽和蛋白质类药物不易被亲脂性膜所摄取，很难通过生物屏障。影响蛋白质药物稳定性的理化因素蛋白质和多肽大分子形成的复杂而特定的空间构象，表现出特异的生物学功能。蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏的理化因素，造成蛋白质和多肽制剂的不稳定。蛋白质和多肽药物不稳定的主要原因化学因素：脱酰胺氧化水解二硫键交换消旋β-消除物理因素：变性凝聚沉淀吸附三、生物技术药物及其制剂的发展前景1、发展概况自1982年第一个重组药物：人工胰岛素上市以来，第二代生物技术药物正在取代第一代多肽、蛋白质类替代治疗剂。第一代重组药物是一级结构与天然产物完全一致的药物；第二代生物技术药物是应用蛋白质工程技术制造的自然界不存在的新的重组药物。4.蛋白质类药物的结构特点与理化性质一、蛋白质的结构特点(一)蛋白质的组成和一般结构蛋白质是由许多氨基酸按一定排列顺序通过肽键相连而成的多肽链。蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成，肽链数目，末端组成，氨基酸排列顺序和二硫键的位置等。组成蛋白质的氨基酸有20多种。连接氨基酸之间的键称为酰胺键，又称肽键，是蛋白质中氨基酸之间连接最基本的共价键。蛋白质结构蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构：一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置。二、三、四级结构为高级结构或空间结构，高级结构和二硫键与蛋白质的生物活性有重要关系。(二)蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构包括二级，三级与四级结构二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有α螺旋结构与β折叠形式。（形成依靠氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。氢键(X—H⋯Y)是处于两个电负性较强的原子X和Y(如F,O,N等)之间的氢原子与Y原子的结合力。）α螺旋与β折叠(二)蛋白质的高级结构三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合的方式，系一条多肽链中所有原子的空间排部。四级结构是指具有三级结构的蛋白质的各亚基聚合而成的大分子蛋白质。蛋白质高级结构蛋白质的四级结构胰岛素的四级结构可以由两个以上的分子量为6000或12000的小亚基聚合而成。所谓亚基就是含有二条或多条多肽链的蛋白质，这些多肽链彼此以非共价链相连，每一条多肽链都有自己的三级结构，此多肽链就是该蛋白质分子的亚单位（亚基）。二条亚基的四级结构丰富多彩的蛋白质世界六条亚基的四级结构蛋白质分子的空间结构蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布。这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。蛋白质分子的空间结构与生物活性蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象时才有生物活性，形成稳定的蛋白质分子构象的作用力：有氢键、疏水作用力（维持蛋白质三级结构起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力）、离子键（维持四级结构）范德华力（维持三级和四级结构）与配位键。二硫键（共价键）除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力。维持蛋白质构象的作用力范德华力对稳定和维持三级，四级结构十分重要。离子键对于维持蛋白质四级结构是不可缺少的。不少蛋白质含有金属离子，而金属离子是通过配位键与蛋白质结合。金属离子配位键二、蛋白质的理化性质(一)蛋白质的一般理化性质1、旋光性2、紫外吸收(苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收)3、蛋白质两性本质与电学性质在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，在一定pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下蛋白质会成为阳离子，阴离子或二性离子(二)蛋白质不稳定的原因1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解，氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换。有时几种反应同时进行蛋白质药物不稳定性蛋白质水解(被酸，碱和蛋白酶催化水解)蛋白质的氧化(氧化剂有分子氧、过氧化氢、过甲酸、氧自由基等)外消旋作用(碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用)二硫键（-S-S-）及其交换二硫键的数目愈多，则结构稳定性和抗拒外界因素的能力也愈强。蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响其生物活性。2、由非共价键引起的不稳定性引起蛋白质不可逆失活作用的三种主要类型：聚集宏观沉淀和表面吸附（浓度低，吸附相对较高）蛋白质变性（如发生溶解度的降低、旋光值改变）这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起。非共价的静电力，氢键，疏水的相互作用以及蛋白质的水化，可以因温度与pH而发生改变。蛋白质的变性也可以说是从肽链的折叠（refolding)状态变到伸展（unfolding)状态。天然蛋白质在体内条件下，具有呈现全部生物功能所需要的精确的构象。变性作用是天然蛋白质分子结构的松解，即由原来有规则，紧密结构变成无规则，松散结构。蛋白质类药物制剂的评价1、制剂中药物的含量测定2、制剂中药物的活性测定3、制剂中药物的体外释药速率测定4、制剂的稳定性研究（物理和化学稳定性）5、体内药动学研究6、刺激性和生物相容性研究生物技术药物的特点1．蛋白质或多肽类药物大多为内源性物质，临床使用剂量小，药理活性高，副作用小，很少有过敏反应；2．蛋白质或多肽类药物稳定性差，在酸碱环境或体内酶存在下极易失活；3．蛋白质或多肽类药物分子量大，还时常以多聚体形式存在，很难透过胃肠道粘膜的上皮细胞层，故吸收很少，不能口服给药，一般只有注射给药一种途径；4．蛋白质或多肽类药物体内生物半衰期较短，从血中消除较快，因此在体内的作用时间较短，往往不能充分发挥其作用。生物技术药物给药系统的研究开发对于蛋白质或多肽类药物的普通注射剂，关键是提高其稳定性；对于体内生物半衰期较短的蛋白质或多肽类药物，需要研究其长效制剂，以延长作用时间；对于需要长期给药的蛋白质或多肽类药物，要研究可减少给药次数的新剂型；研究开发生物技术药物的非注射给药新剂型，如鼻腔给药系统、肺部给药系统及口服给药系统等。基因传递系统需要解决安全性、靶向性等问题。第二节多肽、蛋白质药物的注射制剂一、蛋白质类药物的一般处方组成目前临床上应用的蛋白质类药物注射剂，冷冻干燥型注射剂（冷冻干燥型比较稳定，但工艺较为复杂）溶液型注射剂1)溶液型使用方便，但需在低温（2~8℃）下保存。2）不能冷冻和振荡3）开封后室温下6～12h内使用在多肽、蛋白质药物的溶液型注射剂中常用的稳定剂包括缓冲剂、盐类、表面活性剂类、及糖类、氨基酸和人血清白蛋白(HSA)等。溶液型蛋白质类药物的稳定化方法（1）缓冲剂一般说来pH值和离子强度对蛋白质的稳定性及溶解度都有很大影响，通常在蛋白质药物溶液配制中采用适当的缓冲系统是很必要的。（2）盐类盐类除了影响蛋白质的稳定性外，其浓度对蛋白质的溶解度与聚集均有很大影响。盐类盐的双重作用：稳定和破坏，还有可能毫无影响主要取决于盐的种类、浓度、离子相互作用的性质及蛋的电荷低浓度的盐通过非特异性静电作用提高蛋白质的稳定性（3）表面活性剂离子型表面活性剂常会引起蛋白质变性。少量的非离子型的表面活性剂(主要是聚山梨酯类)具有防止蛋白质聚集的作用。可能的机理是表面活性剂倾向性地分布于气/液或液/液界面,防止蛋白质在界面的变性等。聚山梨酯类可用于单抗制剂和球蛋白制剂等。（4）糖类糖类与多元醇等可增加蛋白质药物在水中的稳定性,这可能与糖类促进蛋白质的优先水化有关。常用的糖类包括庶糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖；常用的多元醇有甘油、甘露醇、山梨醇、PEG和肌醇等。（5）血清蛋白血清蛋白可以稳定多肽、蛋白质药物人血清蛋白（HAS）可用于人体,在一些市售的生物技术药物制剂中已被用作稳定剂,用量为0.1%～0.2%。HAS易被吸附,可减少蛋白质药物的损失；可部分降低产品中痕量蛋白质酶等对蛋白类药物的破坏可保护蛋白质的构象可作为冻干保护剂,如在白介素-2、干扰素和组织纤溶酶原激活素(t-PA)等制剂中。（6）氨基酸一些氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺等,可以增加蛋白质药物在给定pH下的溶解度,并可提高其稳定性,用量一般为0.5%～5%。其中,甘氨酸比较常用。氨基酸除了可降低表面吸附和保护蛋白质的构象之外,还可防止多肽、蛋白质药物热变性与聚集。氨基酸类可稳定干扰素、EPO、尿激酶和门冬酰胺酶等。2.注射用无菌粉末多肽、蛋白质药物注射用无菌粉末在临用时加注射用水或专门的稀释液溶解,如人生长激素(hGH)冻干制剂配有2.5ml的稀释液(装于5ml安瓿中),其中含0.3%的防腐剂(甲酚)和1.7%的等张调节剂(甘油),pH为7.5。溶解后一般也要求在2～8℃下保存,不能冷冻或振摇,并按要求在规定时间内使用,有的还需要避光。设计多肽、蛋白质药物的注射用无菌粉末（冷冻干燥制剂更为常用）时，一般可考虑加入填充剂、缓冲剂和稳定剂等。固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺1.冷冻干燥蛋白质药物制剂2.喷雾干燥蛋白质制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂选择适宜的辅料，提高蛋白质类药物在干燥状态下长期稳定性冷冻干燥工艺过程中参数的优化，如最低、最高干燥温度，干燥时间、真空度等冷冻干燥方法虽然可以改善蛋白质类药物制剂的稳定性。但如果没有适宜的辅料的蛋白质溶液进行冷冻干燥仍然能引起蛋白质不可逆的破坏。从液态到固态的相变过程中，蛋白质周围水分子被除去高浓度的盐和缓冲液组分的结晶缓冲液pKa对温度敏感而导致pH变化浓缩时蛋白质有限的溶解度制剂的冷冻温度饼状物融化或塌陷的温度产品降解温度冷冻干燥过程中易失活的因素冷冻干燥蛋白质制剂中典型的添加剂喷雾干燥蛋白质药物制剂该方法制得的蛋白质干燥粉末已广泛用于吸入途径给药的蛋白质制剂中，在制备蛋白质类药物的控释制剂、开发新的给药系统，该方法极为有用加入稳定剂：蔗糖损失大、含水量高二、新型注射给药系统延长蛋白质药物血浆半衰期就需要改变蛋白质的体内药物动力学性质，可以对蛋白质的分子进行化学修饰以抑制其药理清除达到延长蛋白质类药物血浆半衰期的目的。PEG化除了化学修饰外，用控制药物释放来延长药物在体内的作用时间，达到提高疗效的目的。这方面的研究有控释微球制剂与脉冲式给药系统。（一）控释微球制剂生物可降解材料有：聚乳酸（PLA）聚乳酸乙醇共聚物（PLGA）聚乙二醇(PEG)制成生物可降解的微球剂，达到控制释放。制备方法：喷雾干燥法复乳液中干燥法低温喷雾干燥法超临界萃取法40μm5μm40μmPLGA微球W/O液中干燥法PLGA微球O/W液中干燥法ABC(A)PLGA15000(B)PLGA20000(C)PLGA30000PLA微球光镜照片（×160）PLA微球电镜照片(×2000)此类制剂尽管有发展前景，但仍存在许