2012 胡萝卜组织培养

植物的组织培养第二节胡萝卜的组织培养预备任务•2人/组，2组/1个无菌操作台。•每组取如下工具放于无菌操作台上先行灭菌从306取培养皿、镊子；从316室取1瓶无菌水和8瓶培养基；带1个500mL的烧杯，作废液缸；1个500mL的烧杯装工业酒精100mL。•注意放置物品时，先关灭紫外灯，放好后，关上门，再开启紫外灯；托盘不能放到无菌操作台里，要带回来。一、组织培养基本原理•全能性植物体的每一个完整的细胞都拥有形成完整植株的全部遗传信息，在一定的条件下都具有产生一株完整个体的潜在能力。•去分化去除外植体原有的分化性状，重新进入新的发育分化状态。二、组织培养的方法和步骤•选择原则：根据培养目的、易于诱导、带菌少。生理状态：幼嫩的组织取材季节：易成活，生长旺盛植物的长势：生长健壮的组织外植体大小：应根据培养目的而定胚胎培养或脱除病毒，则外植体宜小；快速繁殖，外植体宜大。一般外植体大小在0.5～1.0cm为宜。1、培养材料的采集2、外植体的表面消毒处理•外植体的表面清洗：洗衣粉清洗，吐温。•外植体表面灭菌（一般采用2次灭菌法）先用70%酒精浸10～30s；转到其它消毒溶液，灭菌液要充分浸没材料。•无菌水涮洗涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。灭菌剂使用浓度（%）消毒难易灭菌时间灭菌效果酒精70-75易0.1-3好氯化汞0.1-0.2较难2-10最好漂白粉饱和溶液易5-30很好次氯酸钙9-10易5-30很好次氯酸钠2（活性氧）易5-30很好过氧化氢10-12最易5-15好抗菌素4-50mg/L中30-60较好3、制备外植体与接种•将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊子等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手接触材料。•在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种2~4个，防止交叉污染。•接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。三、无菌操作步骤•接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开紫外线灯进行杀菌；•接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；•接种员洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，换穿拖鞋等；•上工作台后，用酒精棉球搽拭双手（特别是指甲处）和工作台面；•用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；•接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；•接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。四、本实验—胡萝卜的接种培养•2人/组，8瓶/组，留2瓶下次用；•把胡萝卜切成约4cm的段，怎么切呢？•去除表皮，去除木质部和髓；•切成约40×20×10mm的条状，共切4块。皮层韧皮部形成层木质部1、胡萝卜的切块处理•把切好的材料，放在100mL的烧杯里，加入75％酒精（现配100mL），浸泡30秒；•然后将外植体转入0.2％升汞中（250mL烧杯装100mL升汞），浸泡25－30分钟；•把带有升汞的烧杯拿到超净工作台，取出材料，放入培养皿，用无菌水洗4－5分钟，重复3次。2、消毒和清洗•把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的培养皿里，去除表面一层，然后切成约8×8×5mm的块；•把切好的材料，用烧过的镊子夹到锥形瓶里，2~3块/瓶，包好封口膜和牛皮纸；•将培养基放回316原位，在23~28℃恒温避光条件下培养。3、接种与培养五、注意事项•防火实验中要常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全；手上涂酒精，要干后才能接近火源。•无菌操作材料经升汞消毒后，还需严格进行无菌操作；为防止染菌，手要用酒精擦干净，镊子和刀经常在火焰上烧，锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。•废液处理实验完后，75%酒精和工业酒精，均应倒回到工业酒精的罐中；升汞有剧毒，小心不要溅出，废液倒回原处；酒精和升汞千万别搞混。六、常见错误举例•材料切得过小。•材料消毒时间过长。•切材料时下面没垫滤纸。•镊子、刀在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里。•操作时，手、三角烧瓶在盛材料的培养皿上方活动，容易把菌带到材料上。•把接种的切块压入培养基里面。•接种时瓶口垂直向上，手、镊子上的脏物掉到瓶里。•升汞回收倒入酒精桶里。七、课后作业及预习•课后作业有几种常用的外植体消毒液？主要原理是什么？效果如何？•预习根癌农杆菌转化的原理及方法。•材料处理1）配75%酒精，倒升汞；2）把胡萝卜切成约4cm的段；3）去除表皮、木质部和髓，切成约40×20×10mm方块，4条。•消毒和清洗4）把切好的材料，放在100mL的烧杯里，加入75％酒精，浸泡30秒；5）然后将外植体转入0.2％升汞中，浸泡25~30分钟，不能超过30分钟；6）把带有升汞和组织材料的烧杯拿到超净工作台，取出材料，放入培养皿，用灭菌水洗4~5分钟，重复3次，用滤纸吸干。•接种与培养7）把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的培养皿中，去除表面一层，然后切成约8×8×5mm的块；8）用烧过的镊子将外植体放到培养基上，3块/瓶；9）盖好封口膜和牛皮纸，放回316，23~28℃，避光培养。实验步骤安全第一