(上课用)1.2基因工程的基本操作程序

课本知识回顾基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。基因拼接技术DNA重组技术基因修饰改造定向地DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”──“分子缝合针”──“分子运输车”──限制酶DNA连接酶基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶主要是从的一种酶。识别双链DNA分子的某种并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。形成两种末端原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列磷酸二酯键粘性末端平末端二、“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：2、作用部位：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶磷酸二酯键基因进入受体细胞的载体通常有三种:在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在基础上进行过的质粒λ噬菌体衍生物动植物病毒天然质粒人工改造基因的结构原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等原核细胞的基因结构RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质的DNA序列内含子：不能编码蛋白质的DNA序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的编码区是间隔的、不连续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。（2）没有转译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。启动子与终止子启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。基因工程的基本操作流程获取目的基因从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成基因组文库和部分基因文库基因组文库部分基因文库基因组文库和部分基因文库cDNA合成过程第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。利用PCR技术扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。构建表达载体表达载体的组成1.目的基因2.启动子3.终止子4.标记基因基因工程载体的构建需要考虑哪些因素（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法将目的基因导入受体细胞（动物细胞）显微注射法将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）Ca2+处理目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:功能活性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测归纳步骤归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译基因操作的基本步骤1、基因工程又叫做________或__________。基因工程基因拼接技术DNA重组技术2、基本工具：“分子手术刀”“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体3、基本操作步骤：运载体DNA连接酶限制性核酸内切酶1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建（核心）3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定黏性末端黏性末端限制性核酸内切酶一种限制性内切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）来源：主要从原核细胞分离作用：作用结果：EcoRI重难点剖析基因工程的“专用工具”平未端（SmaI）及粘性未端（EcoRI）1、种类：2、作用部位：E·coliDNA连接酶（黏性末端）T4DNA连接酶（黏性末端和平末端）磷酸二酯键DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。DNA连接酶——“分子缝合针”分子运载车——运载体（1）作用：将目的基因送入受体细胞（2）具备的条件：a.能自我复制.b.有切割位点.c.有标记基因.d.对受体细胞无害.质粒、噬菌体、动植物病毒（3）种类：质粒——细菌拟核DNA外能自主复制的很小的环状DNA分子（一）目的基因的提取目的基因：主要是___________________。获取方法：1、____________中获取目的基因2、人工合成法：化学方法合成DNA片段（DNA合成仪）3、PCR反应扩增DNA基本操作步骤从基因文库编码蛋白质的结构基因原理：DNA复制过程：加热DNA解链冷却引物结合到互补DNA链互补链合成条件：耐高温DNA聚合酶基因文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库某种生物的mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录（二）基因表达载体构建1、基因表达载体由________、_______、________、______四部分组成。目的基因启动子标记基因终止子2、启动子作用：3、标记基因的作用：RNA聚合酶识别和结合的位点鉴别受体细胞中是否含有目的基因筛选出含目的基因的细胞（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用_______________切断目的基因，使其产生____________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶重组质粒形成过程:导入植物细胞：（三）将目的基因导入受体细胞导入动物细胞：导入微生物细胞：受体细胞导入方法体细胞受精卵受精卵显微注射法Ca2＋处理法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法将目的基因导入微生物细胞原核生物繁殖___、多为___细胞、遗传物质相对较___，故早期常作为受体细胞。大肠杆菌细胞用Ca2+处理感受态细胞重组表达载体DNA溶于缓冲液混合转入快单少目的基因是否插入转基因生物染色体的DNA：（四）目的基因的检测与鉴定目的基因是否表达：目的基因是否转录：方法:DNA分子杂交方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测—