白藜芦醇与衰老药理学

ResveratrolandThePharmacologyofAgingANewVertebrateModeltoValidateanOldMoleculeCellCycle5:10,1027-10321白藜蘆醇與衰老藥理學一種新型脊椎動物模型驗證了一個古老的分子DarioRiccardoValenzano,AlessandroCellerino摘要昀近，葡萄和紅酒中發現的天然植物抗毒素白藜蘆醇因為其在酵母，蠕蟲和蠅類中具有延長壽命的積極作用而聲名鵲起。哺乳動物細胞體外培養顯示白藜蘆醇具有抗癌和抗炎作用，這提示其對人類健康和延長壽命可能有積極的作用。研究白藜蘆醇對於脊椎動物衰老的作用顯然是一個密切相關的課題。我們已經研究了白藜蘆醇對於一種非常短壽命的脊椎動物非洲齒鯉的作用。白藜蘆醇治療延長了這種魚的壽命，延緩了衰老相關機能障礙的發生。該結果證明了白藜蘆醇作為第一種分子在不同的機體：酵母，蠕蟲，蠅類和魚類中都延緩了衰老的發生。同時也提示了這種短壽命的魚類能夠作為藥理學研究的模式動物。而且，與棘魚，雞泡魚紅鰭多紀魨和黑青斑河豚有親緣關係，甚至與青鱂有更密切的關係。這些魚類模型昀近在基因組學上取得的進展將有利於非洲齒鯉將來成為研究衰老領域的一個完整的模式系統。衰老藥理學尋找能夠抑制衰老相關病理發生的分子是當代醫學研究中非常重要的課題。然而，任何衰老藥理學研究都需要面對可用模式動物壽命而產生的阻礙，這限制了大規模的藥物研發。雖然有這麼多困難，但是已經證明了幾個小分子和食物一起給藥時，能夠增加模式動物的壽命。其中一些物質，如乙氧基奎寧具有毒性，只能增加短命小鼠株的壽命。其他，如丙炔苯丙胺，是精神活性藥物，屬於監管用藥。自由基衰老理論是一個解釋衰老機制的流行理論，這個理論證明了線粒體產生的活性氧簇是衰老發生發展的重要機制。通過在小鼠線粒體過度表達過氧化氫酶降低氧化應激從而延長壽命和阻止衰老有力地證明了線粒體產生的氧自由基對於脊椎動物衰老的重要性。昀近有報導，p66shc銜接蛋白基因（其缺失能明顯延長小鼠壽命）通過與細胞色素C直接作用產生活性氧簇。這個理論預示著外源性補充抗氧化劑能夠延長壽命。多種抗氧化劑，如硫辛酸，丁羥甲苯，乙醯半胱氨酸，亞硒酸鈉，次磷酸鈉，確實能延長果蠅的壽命，而銀杏提取物EGb761及維生素E能延長線蟲的壽命。FDA批准的一個藥物4-丁酸苯酯（PBA）能通過劑量依賴的方式增加果蠅的壽命，但是對兩個品種的果蠅的活化劑量不同，而且有效劑量中毒劑量之間的視窗很小。PBA昀近被批准用於治療尿素迴圈障礙。果蠅中PBA的轉錄被強烈啟動，抑制組蛋白脫乙醯基酶，但是並不清楚這些作用與延長壽命之間的關係。昀近，線上蟲中系統篩選了19種不同功能和結構分類的能影響人體生理的藥物。三種抗驚厥藥（其中兩種獲得FDA批准）能明顯延長壽命：乙琥胺，三甲雙酮和3,3-二乙基－2－吡咯烷酮可能通過直接作用於中樞和外周的神經活動延長線蟲的壽命和延遲衰老。有趣的是，乙琥胺與PBA一樣，是組蛋白脫乙醯基的抑制劑，但是這種組蛋白脫乙醯基的抑制劑如何發揮作用延長蠕蟲的壽命仍然未知。而且，乙琥胺介導的壽命延長嚴格依賴于培養條件：只在20度觀察到陽性作用，15度卻沒有，而且結果因蠕蟲餵養不同食物而不同。總的說來，幾種分子在一種動物模型中能延長壽命，但是其作用機制仍然未知；很少分子在多種模型中被研究，而且很多分子在一種動物模型中的作用甚至缺乏獨立實驗的重複。可以通過食物補充的小過氧化氫合酶/超氧化物歧化酶模擬酶（EUK-8和EUK-134）就是這種情況的典型例子。這些化學物質之所以有名是因為，正如衰老的自由基學說預測的一樣，它們能延長線蟲的生命週期。然而，家蠅餵養相同的過氧化氫酶/超氧化物歧化酶模擬酶卻沒有比對照組更長壽。在超氧化的條件下，EUK-8及EUK-134餵養的家蠅甚至壽命更短。昀後，線上蟲中重複延長壽命的嘗試失敗了，EUK-8及EUK-134不能使野生型蠕蟲更長壽，ResveratrolandThePharmacologyofAgingANewVertebrateModeltoValidateanOldMoleculeCellCycle5:10,1027-10322反而縮短了其壽命。過度表達人類針對線粒體的過氧化氫酶能延長壽命，減少衰老相關的標記物，這提示增強活性的過氧化氫酶有利於延長壽命，但是外源性過氧化氫酶模擬酶的藥理學作用仍不清楚，觀察到的這種情況更為複雜。白藜蘆醇到目前為止，白藜蘆醇是唯一的一種分子能在實驗室中延長不用物種的壽命。白藜蘆醇是在幾種植物中發現的天然植物抗毒素，具有抗真菌的作用。特別是，白藜蘆醇存在於虎杖和葡萄中，這兩種食物都是中國日本和地中海地區基本食物營養的重要成份。白藜蘆醇在紅酒中的含量很高（平均5mg/L,範圍從0.5到10ppm），人體攝取這種化合物的主要來源於紅酒。白藜蘆醇被反復用於解釋所謂的法國悖論，例如飲食中富含飽和脂肪酸的法國人群的心血管疾病的發病率很低，後續的流行病學研究發現適度飲用紅酒能夠降低一系列疾病的風險。實驗室研究顯示這種多酚對哺乳動物有多種有益的作用，如抗腫瘤，抗動脈粥樣硬化，抗炎，激素樣作用，體內體外能夠抑制血小板凝集，具有抗氧化作用和化學預防作用，這是因為其能抑制人體細胞中細胞色素P450酶，這個酶在前致癌物轉變成致癌物中起重要作用。白藜蘆醇研究得昀多的一種特性是在腦，腎和心臟的局部缺血中的保護性作用。考慮到認定口服白藜蘆醇的生物利用度很低，如此廣譜的生物效應令人驚奇。一度認為，白藜蘆醇吸收很快，75%通過糞便排泄損失。剩下的部分主要代謝為葡萄糖醛酸－和硫酸－白藜蘆醇結合物，只有少於2%保留甙元的形式。這就提出了疑問：葡萄糖醛酸－和硫酸－白藜蘆醇結合物在體內可能至少引起某些生物學效應。白藜蘆醇發揮各種生物學效應的同時，也影響了幾種不同的分子的信號通路。體外實驗證明白藜蘆醇微摩爾濃度能阻斷NF-kb(NuclearFactorKB)的啟動，能夠抑制大部分TNF介導的人體細胞反應。而且，亞微摩爾濃度的白藜蘆醇（相當於口服後血液中的生理濃度）能夠調節人內皮細胞依賴NF-kb的轉錄啟動。白藜蘆醇的其他作用包括通過體外啟動NOS上調NO，清除氧自由基（特別是超氧陰離子）和替代泛醇（輔酶Q的簡化形式，ROS的主要生成物）。非常有趣的是，白藜蘆醇針對F1結構域直接抑制線粒體ATP合成酶。所以白藜蘆醇一方面增加自由基NO，另一方面通過多種途徑抑制線粒體自由基的產生。因為葡萄糖醛酸－和硫酸鹽結合物的形式鬆開羥基簇，從而不能直接清除氧自由基，可能沒有抗氧化的直接作用。總的說來，白藜蘆醇是醫學營養學領域的學者所熟知的可能對人體健康具有積極作用的多酚分子，但是考慮到其極低的生物利用度，在脊椎動物中精確的作用機制還需要研究清楚。非脊椎動物模型中白藜蘆醇延長壽命的效應白藜蘆醇因其作用於Sir2家族依賴NAD的組蛋白脫乙醯基酶，對於調節酵母，蠕蟲和果蠅的壽命起重要作用。昀近的研究顯示，白藜蘆醇能夠重複延長酵母和短壽命無脊椎動物的壽命。在體外實驗中，白藜蘆醇啟動sirtuins，sirtuin過度表達從而延長壽命，這個機制提示體內白藜蘆醇可能直接激動sirtuins。昀新的研究對體外酵母Saccharomycescerevisiae依賴白藜蘆醇啟動Sir2產生了懷疑。在脊椎動物，白藜蘆醇顯然只有在螢光基團存在下啟動Sir2同源物SIRT1。但是，脊椎動物和非脊椎動物中，白藜蘆醇模擬了SIRT1過度表達的效應，其中包括神經保護作用。在非脊椎動物中，白藜蘆醇延長壽命需要Sir2.1基因參與。昀近，線蟲的一項研究嘗試更好地定義白藜蘆醇涉及的分子通路。這項研究證實白藜蘆醇延長壽命以及其作用需要Sir-2.1基因參與。而且，白藜蘆醇能進一步增加Sir-2.1過度表達蠕蟲的壽命。但是白藜蘆醇通過Sir2.1延長壽命需要forkhead轉錄因數DAF-16,即使其作用並不是依賴DAF-16。Sir2.1抑制編碼富含穀氨醯胺/天冬氨酸的朊樣蛋白的基因家族的表達。這個蛋白家族與內質網對未折疊蛋白的應激反應有關。白藜蘆醇能抑制這種反應。因為這些基因過度表達導致壽命延長，雖然敲除這些基因沒有觀察到白藜蘆醇對延長壽命的作用，但提示除了推測對Sir2.1的直接作用外，白藜蘆醇也通過阻斷抑制內質網應激基因來延長壽命。Sir2.1及其哺乳動物同源物SIRT1通過限制熱量攝入誘導產生，限制熱量攝入是已知的能延長多種物種壽命的方式。白藜蘆醇治療沒有增加低熱量飲食的果蠅的壽命，因而白藜蘆醇通過啟動Sir2.1，提示可能在酵母，蠕蟲和果蠅中模擬限制熱量攝入的效應。然而，有學ResveratrolandThePharmacologyofAgingANewVertebrateModeltoValidateanOldMoleculeCellCycle5:10,1027-10323者對酵母中的這種機制產生了懷疑。而且，例如白藜蘆醇缺乏累加效應及果蠅低熱量飲食，給予白藜蘆醇不能進一步延長節食個體的壽命，這並不必然意味著限制飲食和白藜蘆醇通過相關的通路發生作用。昀後，已知限制果蠅的熱量攝入是通過不改變速率來延遲死亡概率加速度從而延緩衰老，然而白藜蘆醇卻降低死亡加速度的速率。哺乳動物的研究顯示白藜蘆醇和限制熱量攝入的關係是間接的，依賴于白藜蘆醇介導啟動NOS作用。雄鼠中很多組織的內皮NOS通過限制熱量攝入誘導，從而使CR發生多種改變，如發生線粒體，增加耗氧，表達3’-5’鳥苷酸，重要的是上調SIRT1。白藜蘆醇對短命非洲齒鯉壽命和衰老的作用鑒於白藜蘆醇效應在非脊椎動物中的高重複性，脊椎動物中相似的研究顯示出高度相關性。現有長壽命的脊椎動物模型，例如大於2.5年的小鼠，達到5年的斑馬魚，在衰老研究領域是生物學極限，能夠採用更短壽命的新動物模型來替代。在過去的幾年，我們嘗試發展一種一年卵生齒鯉目非洲齒鯉，也叫“turquoisekillifish”，用於藥理學研究。非洲齒鯉生命週期很短，相當於果蠅的壽命。短壽命與非常快速的生長關係密切，在組織學和行為水準上表達衰老相關的標記物。我們應用這種短壽命魚來檢驗白藜蘆醇對於脊椎動物壽命和某些衰老相關標記物的作用。成年魚長期餵養白藜蘆醇，我們觀察到中位數和昀長壽命隨著劑量增加明顯增加（在昀高檢測劑量分別為56%和59%）。昀低活性劑量在120ug/g（食物）與24ug/g（食物）之間，分別相對於0.5uM和0.1uM。這個劑量明顯低於研究非脊椎動物的劑量10-500uM，這提示相對於非脊椎動物模型，脊椎動物對於白藜蘆醇具有更高敏感性。這些資料提示白藜蘆醇降低衰老率，然而，通過年齡依賴生存率來估計衰老是間接的。壽命可以通過減少獨立於年齡的死亡率（因於年齡衰老無關的死亡率，如感染性疾病或侵襲）來延長。另一方面，衰老率被認為反映了年齡依賴的生物化學損傷的累積，通過年齡依賴的死亡概率加速度來衡量。這兩個參數通過把真實的死亡率曲線擬合死亡率模型衍生得到，在logistic和Gompertzian曲線中能更好擬合真實資料。Logistic曲線模型能更好地描述白藜蘆醇餵養組和對照組的死亡率。我們以死亡率的自然對數log－plot來表示死亡率隨年齡增長而增加，這樣可以進行線性擬合及看到獨立於年齡的死亡率的截距及作為衰老率的斜率（(log-likelihoodratio-testχ21=11,42;p0.001),），這提示與時間依賴少的死亡風險在增加。死亡率增加一倍所需的時間是間接衡量衰老率的方法。我們觀察到，理論上死亡率指數增長時，對照組每3.17天死亡率增加一倍，然而白藜蘆醇餵養組是8.98天。這提示白藜蘆醇餵養組與對照組比較，死亡率加速度下降3倍。有趣的是，食物中添加白藜蘆醇導致死亡率低，但是相反地其導致早期絕對死亡率增加，例如，口服的第一周，白藜蘆醇餵養組的死亡率高於對照組，雖然log-plot的截距顯著高於對照組（(log-likelyhoodratio-testχ21=12,87;p0.001）。這些資料提示白藜蘆醇對魚可能有激效效