实验三：药敏

实验三药敏实验内容一、纸片扩散法（K-B法）二、稀释法(MIC)实验目的一、掌握纸片扩散法的原理、操作方法、结果的判断及其临床意义。二、掌握纸片扩散法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。三、掌握肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判断及临床意义。四、了解稀释法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。纸片扩散法（K-B法）器材与试剂菌种：金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓度至0.5麦氏比浊管（相当于1.5×108CFU/ml)；或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。培养基：水解酪蛋白培养基（MH琼脂）。其他：无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解，不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。方法:（4人一组，2人做金葡菌标准种，2人做临床种，每种菌选4个不同的药物纸片）1、制备MH琼脂平板：将加热融化的琼脂冷却至60℃左右时倾注于直径为9cm的无菌平板中，使琼脂厚度为4mm，待琼脂凝固后使用，如有冷凝水产生，可放置37℃温箱中15-30分钟后使用。2、无菌棉签蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在平板表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板內缘涂布1周。3、平板在室温下干燥5分钟，用无菌镊子将抗菌药物纸片贴于琼脂表面，各纸片中心相距大于24mm，距平板內缘大于15mm，37℃温箱中孵育16-18小时，量取抑菌圈直径。结果观察中的注意事项：1、准确量取抑菌圈直径，若抑菌圈为椭圆形，量其最长径和最短径，取其平均值。2、若出现双层抑菌圈，一般药物测量内圈，而磺胺类药物则量其外圈。3、若抑菌圈内有散在菌落出现，排除污染菌的存在和其他影响因素，若无污染菌等，需重做。结果观察：1、结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照书上的标准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报告。例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药量30微克，抑菌圈≤14mm为耐药，15-16mm为中介，≥17mm为敏感。2、质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围内，如果超出该范围，应为失控，而不发报告，应及时查找原因，予以纠正。例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药量30微克，金黄色葡萄球菌ATCC标准株的抑菌圈应在20-26mm之间。思考题：影响因素？1、培养基的质量：双层抑菌圈的出现？2、纸片质量3、接种细菌的菌量4、孵育的温度和时间5、操作因素稀释法微量稀释法常量稀释法（试管稀释法）常量稀释法（试管稀释法）1、实验目的：用于测量某种药物对测试菌的最小抑菌浓度（MIC）2、实验原理：将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释，再加入定量的测试菌，经一定时间和温度培养后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此菌的MIC。定量的测试菌的制备1、将金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓度至0.5麦氏比浊管（相当于1.5×108CFU/ml)；或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。2、将调好浊度的菌液用无菌肉汤稀释10倍，即可使用。步骤和方法将抗菌药物用肉汤稀释成不同浓度，加入定量测试菌。编号123456789（对照）无菌肉汤管1.811111111（ml）青霉素0.21111111弃去(80单位）稀释的金葡菌0.10.10.10.10.10.10.10.10.1（ml)37℃培养16-18小时结果观察:完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌药对此菌的MIC。此次实验即为青霉素对金黄色葡萄球菌ATCC株和临床株的MIC。结果举例：编号123456789无菌肉汤管1.811111111（ml）青霉素0.21111111弃去(80单位）金葡菌0.10.10.10.10.10.10.10.10.1结果细菌生长-----++++青霉素浓度84210.50.250.1250.0625对照--结果判断:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC影响因素？临床意义？