硕士论文-抗骨肉瘤中药的体外筛选

中山大学硕士学位论文抗骨肉瘤中药的体外筛选姓名：尹军强申请学位级别：硕士专业：骨肿瘤指导教师：沈靖南20040415抗骨肉瘤中药的体外筛选作者：尹军强学位授予单位：中山大学相似文献(10条)1.期刊论文曹庆选.李文华.徐文坚.张通.刘吉华.杨世峰.王倩中药治愈骨肉瘤影像学特征研究-青岛大学医学院学报2006,42(4)目的研究中药治愈骨肉瘤后其影像学特征.方法观察拒绝截肢采用中药治愈的9例骨肉瘤影像学表现,其中4例经活检病理证实,2例诊断骨肉瘤时肺部已发现转移,1例股骨成骨型骨肉瘤同侧胫骨骨骺内有成骨性转移,另外2例经影像学专家按举证倒置程序,论证骨肉瘤的影像学诊断,排除了其他病变的可能.追踪观察6～43年,分别进行X线随访6～23次,其中1例加行CT,2例加行MRI检查随访.结果经中药治愈的病例随访中发现肿瘤破坏的结构、瘤骨等均有向正常骨转化过程,9例均在肿瘤外围新生骨性外壳(骨墙);骨墙内均有成熟的骨小梁和骨嵴新生,8例破坏的骨皮质重新修复,5例骨墙内有钙化,2例髓腔内有钙化,1例骨墙内及髓腔内均有骨髓组织再生.结论经中药治疗后的骨墙形成,可能是骨肉瘤治愈的影像学特征.2.会议论文曹庆选.李文华.徐文坚.张通.刘吉华.曹来宾.夏宝枢中药治愈骨肉瘤影像学新征象研究2007骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,国内外有关骨肉瘤的影像学研究多为治疗前诊断,化疗和放射治疗后治愈的影像学研究,作者尚未见文献报道。本文重新研究著名放射学专家曹来宾教授40余年来搜集的中药治疗骨肉瘤的病例,总结9例治愈后的影像学表现,在平片的基础上与CT、MRI对照,探讨骨肉瘤治疗过程中的病理演变,评价治疗效果及预后,旨在总结骨肉瘤中药治愈的影像学新征象,制定骨肉瘤中药治愈的影像学标准。3.学位论文尹军强抗骨肉瘤中药单体的筛选及蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡相关机理研究2007一、研究背景：骨肉瘤是骨科领域里最常见的恶性骨肿瘤，近二十年来实施的手术联合大剂量化疗，使骨肉瘤手术后五年生存率提高到60-70﹪。由于化疗药物的剂量大、毒副作用大、费用高，尤其是仍有40-50﹪的骨肉瘤患者对现行的化疗方案不敏感以及骨肉瘤的耐药性已经成为进一步提高骨肉瘤患者生存率的瓶颈。目前国际上现行的化疗方案已经很难在骨肉瘤治疗及患者远期生存率方面有突破性的进展。传统中药源自天然，具有长期的临床应用基础，其毒副作用小，治疗有效，作用机理有别于化学合成药物，开发风险也相对较低，展现出巨大的开发潜力和产业发展前景，己成为新药开发和世界医药产业的重要发展方向之一。近年来，中药对恶性肿瘤的杀瘤、抑瘤作用已引起国内外医学界广泛的关注，也是抗癌药物研发的一个有效途径。我们在骨肉瘤的综合治疗程式中，寻找有中国特色的、有效的抗骨肉瘤中药，研究中药及其提取物对骨肉瘤的作用可能为骨肉瘤的治疗开辟一条新的途径。二、研究目的：1.建立中药单体对骨肉瘤细胞系作用的中药筛选研究模型。2.深入开展新有效中药对骨肉瘤作用机制的研究，并与传统化疗药物对照，为临床应用提供实验依据。3.为开发和制取新的对骨肉瘤特异作用的中药创造条件，以进一步开展临床前期研究。三、研究内容：1.筛选出具有明显抑制骨肉瘤细胞增殖的中药单体选取蟾毒灵，华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，高三尖杉酯碱，奇果菌素，冬凌草甲素，槲皮素，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，汉黄芩素，黄芩素，野黄芩苷，黄芩苷，柚皮素丁二酸酯，槲皮苷，异槲皮苷和柚皮素，共16种中药单体，DMSO溶解后，分别取不同浓度梯度，作用骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX'300(氨甲喋呤耐药细胞株)，72小时后，MTT法测定它们对骨肉瘤细胞株的半数有效抑制剂量(IC50)，选用化疗药物氨甲喋呤(MTX)作对照。2.蟾毒灵等中药单体诱导骨肉瘤细胞凋亡及对细胞周期的影响实验设中药单体处理组和空白对照组，利用下列方法来检测蟾毒灵等中药单体诱导骨肉瘤细胞凋亡及对细胞周期的影响：①细胞形态学及Hoechst33258细胞核染色，观察中药单体诱导骨肉瘤细胞凋亡的细胞形态学变化；②流式细胞仪技术及AnnexinV/PI双标染色，分析细胞凋亡率及细胞周期；③DNA琼脂糖凝胶电泳，观察细胞DNA降解梯形条带的电泳图改变。3.探讨蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡作用的分子机制Westemblotting法检测各组细胞的P53、Bax、Bcl-2和caspase-3凋亡相关蛋白的表达。4.探讨蟾毒灵对骨肉瘤氨甲喋呤敏感及耐药细胞株的二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的影响利用RT-PCR及Westemblotting法，检测蟾毒灵处理的U-20S及U-20S/MTX'300两株细胞DHFR的mRNA转录水平和蛋白的改变，探讨蟾毒类单体是否对DHFR的表达有影响。四、研究结果：1.选取骨肉瘤细胞系，体外培养骨肉瘤细胞为药物实验模型，用MTT法及细胞形态学观察，在细胞水平检测了16种中药单体的体外抗骨肉瘤作用，发现存在肿瘤抑制作用的(根据IC50值及细胞形态学改变)有13种；其中能够以较低浓度抑制骨肉瘤细胞生长及增殖的中药单体有10种，对骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX'300(氨甲喋呤耐药细胞株)的IC50值分别为：2.蟾毒灵等中药单体对骨肉瘤细胞株进行处理后，检测其诱导骨肉瘤细胞凋亡及对细胞周期的影响，发现①在形态学上，部分细胞变圆，变圆细胞呈体积缩小，折光性增强。随着药物浓度增大和作用时间的延长，变圆细胞逐渐增多，细胞表面逐渐凸起小膜泡(即凋亡小体)，部分细胞脱壁并见坏死细胞及碎片。而对照组细胞生长活跃，核分裂像多见，细胞异型性明显。Hoechst33258染色可见细胞核染色质出现浓缩状态，凝集成块的凋亡改变，染色有核裂解、固缩、深染的凋亡细胞出现；②流式细胞仪发现蟾毒灵对骨肉瘤细胞株具有促进凋亡的作用，且凋亡率随着浓度的增加而增加，与对照组相比具有明显的差异性(P0.01)，提示蟾毒灵诱导细胞凋亡存在一定的浓度依赖性；蟾毒灵处理后的细胞，G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例增加，表明蟾毒灵是通过将细胞阻止在G2/M期来抑制肿瘤细胞的增殖。③DNA琼脂糖凝胶电泳：10-100ng/ml浓度的蟾毒灵处理48时后，骨肉瘤细胞的DNA电泳出现凋亡的特征性“梯状”条带。3.为了探讨蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡作用的分子机制，利用Westernblotting检测凋亡相关蛋白p53，caspase-3，Bax及Bcl-2的表达：蟾毒灵(10-100ng/ml)处理骨肉瘤细胞株48小时后，Bcl-2蛋白的表达随浓度增加而降低，而p53，Bax的表达随浓度增加而升高，caspase-3出现明显活化；Bax/Bcl的比率也随着药物随着浓度的增加而升高。提示蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞凋亡是通过影响上述凋亡相关蛋白的表达而作用的。4.利用RT-PCR及Westernblotting法，检测蟾毒灵处理的细胞DHFR的mRNA转录水平和蛋白水平的改变，结果发现蟾毒灵处理后，细胞的DHFR在mRNA转录水平和蛋白水平均无明显变化。提示蟾毒灵作用效果不受高表达DHFR影响的同时，也不影响骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX'300的DHFR的表达。五、研究结论：1.通过对16种中药单体的筛选，能明显抑制骨肉瘤细胞生长及增殖的中药单体有：蟾毒灵，高三尖杉酯碱，华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，槲皮素，奇果菌素，冬凌草甲素，EGCG，汉黄芩素和黄芩素。2.蟾毒灵体外能显著抑制人骨肉瘤细胞U-20S及U-20S/MTX'300的生长并能诱导细胞凋亡，诱导肿瘤细胞凋亡可能为蟾毒灵主要的抗肿瘤机理之一。蟾毒灵抑制细胞生长是通过将细胞阻滞在G2/M期，而诱导骨肉瘤细胞凋亡主要与影响凋亡相关蛋白p53，caspase-3，Bax，Bcl-2的表达有关。3.蟾毒灵对骨肉瘤细胞株的显著增殖抑制作用不但对骨肉瘤U-20S敏感细胞株有效，对氨甲喋呤耐药细胞株U-20S/MTX'300也同样有效，其作用效果不受高表达DHFR的影响，提示蟾毒灵有希望成为对MTX耐药病人的候选治疗药物。4.期刊论文张俐.于波.林建华.ZHANGLi.YUBo.LINJian-hua中药片仔癀胶囊对骨肉瘤U-2OS细胞诱导凋亡的作用-中国骨伤2009,22(4)目的:研究中药片仔癀对骨肉瘤U-2OS细胞的诱导凋亡作用.方法:①采用1月龄SD大鼠16只,雌雄各半,体重120g左右,随机分为2组(空白血清组和片仔癀治疗组),每组8只.空白血清组大鼠灌服PBS,片仔癀治疗组大鼠灌服中药片仔癀溶液.②人骨肉瘤U-2OS细胞培养于舍10%胎牛血清,青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml的RPMI1640培养液中,置于37℃、5%CO,2饱和湿度的细胞培养箱中培养.用MTT法检测不同含药血清浓度对骨肉瘤U-2OS细胞增殖的影响,筛选对骨肉瘤U-2OS细胞作用最佳的片仔癀含药血清浓度.③在倒置相差显微镜和电镜下观察骨肉瘤U-2OS细胞形态.④TUNEL原位末端标记法检测细胞的凋亡.⑤提取基因DNA,琼脂糖凝胶电泳,以DNA琼脂糖凝胶电泳和透射电镜检测细胞凋亡.结果:①20%片仔癀含药血清对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用最佳.②倒置相差显微镜观察可见空白血清组细胞呈梭形贴壁生长,在20%片仔癀胶囊含药血清组,可见部分细胞体积变小、变圆,细胞膜完整但出现发泡现象,折光性增强.随作用时间延长,变圆细胞逐渐增多,部分贴壁细胞皱缩、变圆、脱落,可见坏死细胞及碎片.③20%片仔癀胶囊含药血清组,TUNEL检测阳性.④DNALadder电泳结果:含药血清组细胞基因DNA凝胶电泳出现明显的梯状带.⑤透射电镜观察染色质沿皱缩的核膜下凝聚,细胞表面出现凋亡小体.结论:中药片仔癀胶囊对骨肉瘤U-2OS细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用.5.期刊论文黄金昶中药为主治疗骨肉瘤22例浅析-中医药学刊2004,22(10)手术仍是骨肉瘤主要治疗手段,但或因肉瘤部位特殊或因术后复发转移或因经济方面原因,许多患者不愿或不能接受手术,寻找有效的经济的保肢治疗是非常重要的.笔者于1997年始应用自制骨瘤消胶囊治疗骨肉瘤患者22例,疗效满意.现将初步随访结果,介绍如下:6.期刊论文贾克东.宋永茂.石淑仙抗病毒中药配合手术治疗骨与软组织肉瘤-现代中西医结合杂志2003,12(9)目的探讨抗病毒中药在治疗骨与软组织肉瘤中的应用价值.方法以板蓝根、双花、地丁等具有抗病毒效果的中药为主药治疗骨与软组织肉瘤患者16例,并分别随访5～15年.结果除5例分别于治疗后2个月、2个月、1年、3年、5年死亡外,其余11例健康存活,全身体格检查及胸部X线检查均未见转移征象.结论具有抗病毒作用的中药能够有效地预防骨与软组织肉瘤的术后复发.7.期刊论文古建立.李东升.杜志谦.张志勇化岩胶囊治疗骨肉瘤27例-陕西中医2002,23(12)目的:观察中医药治疗脾肾气虚、寒痰瘀骨型骨肉瘤的疗效.方法:应用化岩胶囊治疗脾肾气虚、寒痰瘀骨型骨肉瘤27例,与鬼臼乙叉甙胶囊治疗为23例对照组进行比较.结果:试验组对骨肉瘤体积变化和局部及全身疼痛变化,与对照比较差异无显著意义(P＞0.05),试验组与对照组从提高生活质量和提高生存率方面比较差异有显著性意义(P＜0.05).提示:化岩胶囊可作为治疗骨肉瘤的辅助药物.8.学位论文李德华补肾解毒散结方诱导人骨肉瘤U-2OS细胞凋亡及其机制的研究2008目的：探讨补肾解毒散结方促进人骨肉瘤U-2OS细胞凋亡的作用和探讨其诱导凋亡的作用机理,初步阐明补肾解毒散结方抗骨肉瘤的部分机制,为中药复方治疗骨肉瘤提供实验依据。方法：1.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测补肾解毒散结方对人骨肉瘤U-2OS细胞的增殖抑制作用。2.采用流式细胞法(FCM)检测补肾解毒散结方对人骨肉瘤U-2OS细胞凋亡和细胞周期的影响。3.采用实时荧光定量.聚合酶链式反应(Real-timePCR)法检测补。肾解毒散结方对人骨肉瘤u-2OS细胞p53、bcl-2基因表达的影响。4.用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包(PEMS3.1)统计