磺胺类药物

磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称,其通过干扰细菌的酶系统对氨基苯甲酸的利用而发挥抑菌作用,后者是微生物生长必需物质叶酸的组成部分。自20世纪30年代研究证明了SAs抑菌的基本结构后,相继合成了各种SAs,由于其抗菌谱广,价格低廉,目前仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一,但也带来了食品安全和环境污染等系列问题。研究表明与其它常用抗生素相比,SAs可能更易诱导菌株应选择压力而产生耐药性。此外,SAs药物还会导致过敏反应、尿和造血功能紊乱等副作用。如磺胺二甲基嘧啶等可能诱发啮齿类动物如鼠的甲状腺增生,对其激素样效应和潜在致癌性质正在进一步研究中。由于SAs在体内作用和代谢的时间较长,通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积,蓄积浓度超过一定值时将对人体机能造成损害。因此,联合国食品法典委员会(CAC)和许多国家规定,食品和饲料中SAs总量以及磺胺二甲基嘧啶等单个SAs的量均不得超过011mg/kg。而且伴随兽药残留毒理学的发展和风险分析手段的进步,各国对SAs在动物源性食品中的残留限量做出了越来越严格的规定,如日本对食用动物肌肉中磺胺二甲基嘧啶的最大残留限量规定为方法检测低限,即0101mg/kg。关于SAs残留的检测从早期的分光光度法、荧光法、薄层色谱法到近些年的液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法、毛细管电泳法和超临界流体色谱法,几乎所有的分析理论和技术在SAs残留分析中都得到了研究和应用,其中采用最多的筛选方法是反相高效液相色谱法(HPLC),后来发展的酶联免疫吸附测试方法(ELISA)作为筛选方法也得到了广泛的应用。但是这些检测方法都存在处理方法繁琐,操作时间长及只能检测单个磺胺类药物的问题。基于细菌受体分析的CharmⅡ放射免疫法的样品前处理提取方法简便,具有灵敏度高,特异性强的特点,并且可以检测磺胺类残留总量,已经为欧盟国家和美国FDA认可并且应用于初筛分析,目前国内尚未见有关鳗鱼的检测报道。本研究建立了鳗鱼中磺胺类残留CharmⅡ放射免疫检测方法。1材料和方法1．1设备和材料Charm6600/7600分析仪:美国Charm公司生产;IEC离心;均质器;涡旋混合器;恒温孵育器(65±1℃;80±2℃);闪烁液加液器;50mL离心管;硼硅玻璃试管及试管塞;pH试条;药片压杆。1．2样品和试剂1．2．1检测基质鳗鱼1．2．2检测试剂磺胺类CharmⅡ检测试剂盒;闪烁液(Optifluor);阴性对照液;多抗标准品。以上试剂均由美国Charm公司提供。1．2．3磺胺类药物标准品磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹噁啉(SQX)、磺胺甲噻二唑(STZ)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺异噁唑(SIZ)、磺胺甲基异噁唑(SMZ)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺噻唑(ST)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺氯哒嗪(SCP)。以上标准品由Sigma公司提供。1．2．4恩诺沙星、新霉素、庆大霉素、链霉素、螺旋霉素、林可霉素、四环霉素、氯霉素、红霉素、青霉素G标准品。以上标准品由Sigma公司提供。1．3方法1．3．1测试原理测定的基础是竞争性受体免疫反应。用[3H]标记的磺胺二甲嘧啶(示踪剂)与样品中磺胺类药物的竞争结合试剂(微生物细胞上的特异性受体)上的磺胺结合位点,当样品中残留磺胺类药物时,残留物与受体上的结合位点结合,从而阻止了[3H]标记的磺胺类药物与结合剂位点的结合。样品中的磺胺类药物含量越高竞争的结合位点越多,[3H]标记磺胺二甲嘧啶的则越少,用CharmⅡ分析仪测定样品中的[3H]含量的cpm(每分钟脉冲数)值,cpm值越低则样品中的磺胺类药物残留量越高。1．3．2提取步骤(1)取50mL离心管,加入10g均质好的鳗鱼糜样。(2)加入30mLMSU提取缓冲液,强力振荡离心管10min后进入步骤(3)。(3)将离心管置80±2℃孵育器内孵育45min。(4)再将离心管置冰水内10min。(5)于1750g(IEC离心机313×1000rpm)离心10min。(6)吸出上层液用于测试。注意不要将漂浮的脂肪颗粒混入上清液内。1．3．3测定步骤(1)用药片压杆的平端,将白色药片(受体试剂片)压入一洁净的玻璃试管内。(2)加300μL蒸馏水到试管内用涡旋混合器振荡10s至药片破碎。(3)用加样器加4mL样品到试管内。(每一样品用一新加液吸嘴)。(4)用笔的平端,压入粉红色药片([3H]标记的磺胺二甲嘧啶)。用振荡器振荡大约15s。(5)置65±1℃孵育器内,孵育3min。(6)1750g(IEC离心机313×1000rpm)离心3min。(7)离心停止后立即取出试管,倒掉上层液,用棉签清除试管内的脂肪环并吸干管壁内的残渍,不要接触沉淀物。(8)加300μL蒸馏水到试管内,振荡使沉淀物完全破碎。(9)加3mL闪烁液到试管内涡旋混匀至试管内没有不均一的云絮状物。(10)试管放入CharmⅡ/7600分析仪内。(11)按CharmⅡ/7600分析仪操作程序选项(检测控制点需预先设定并输入仪器),读[3H]项的cpm值。1．3．4阳性结果的确定样品的cpm控制点时,需要重新检测样品及同时测定一个阴性质控和一个阳性质控,以确定试剂和设备是否工作正常。通常情况下:(1)测试的阴性质控应该是阴性质控平均值±20%(每一试剂盒都会给出阴性质控平均值,平均值一般为运行三份阴性质控液的cpm值的平均数)。(2)测试的阳性质控应该小于控制点。如果重测样品的cpm控制点且(1)(2)两条件符合,则判定样品阳性。1．3．5控制点的建立在6份已知无磺胺类残留的鳗鱼样品中加入测试所要求的抗生素浓度(参照试剂盒说明书)。按照分析程序运行(见11313方法)。得出6个cpm值,计算其平均值。平均值的130%即为此类样品的控制点。2结果与分析211抗原抗体竞争性反应标准曲线将浓度为1000μg/L的多抗标准品添加入阴性鳗鱼样品中,添加浓度分别为10、20、30、40、50、80、100、150、200μg/kg,按11313测定步骤检测其cpm值,结果如图1和图2。任何受体分析的灵敏度都存在限制,CharmⅡ放射免疫分析中细菌受体和[3H]的磺胺二甲嘧啶抗原的量是固定的。从图1可以看出,当样品中竞争性磺胺二甲嘧啶浓度达到50μg/kg时,浓度继续增加则其竞争效率下降,表现为斜率绝对值变小,cpm值读数变化很小。抗原质量浓度达到200μg/kg时,分析体系已接近饱和。在磺胺二甲嘧啶添加浓度为10～50μg/kg的范围内,以质量浓度对数为横坐标,以相应质量浓度的cpm数值的相对值(即其cpm读数与阴性样品cpm读数的比值,B/Bo)为纵坐标,得到半对数曲线,如图2。因为是以细菌细胞壁受体作为抗原的结合位点,其亲和性不均一,而且抗原抗体反应的复杂性使得不能得到相关系数很高的线形拟合,但是从图2可以看出在添加浓度为10～50μg/kg的范围内,分析体系是比较灵敏的。根据实际情况确定检测限时,考虑到分析相对标准偏差,一般要求空白加标样品与空白样品的cpm相对值小于016,即鳗鱼中磺胺二甲嘧啶检测浓度须大于11129μg/kg。2．2特异性验证实验本实验室选取阴性鳗鱼样品,分别加入13种磺胺类药物标准品[分别为磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹噁啉(SQX)、磺胺甲噻二唑(STZ)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺异噁唑(SIZ)、磺胺甲基异噁唑(SMZ)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺噻唑(ST)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺氯哒嗪(SCP)],添加水平为50μg/kg,测定加标后cpm值,与控制点cpm值1357相比较,结果添加13种磺胺类标准品的样品测定结果阳性率为100%。另外添加恩诺沙星、新霉素、庆大霉素、链霉素、螺旋霉素、林可霉素、四环素、氯霉素、红霉素、青霉素G的混合标准品,添加水平为1000μg/kg,样品测定结果均为阴性。上述实验验证了CharmII放射免疫分析法测定鳗鱼中磺胺类残留的特异性能满足检测要求。2．3最大残留限量MRL验证现在日本等一些国家把磺胺类最大残留限量从100μg/kg降为50μg/kg,我们对放射免疫法在此水平的检测灵敏度做了加标验证。首先按11315控制点的建立方法确定鳗鱼中磺胺类检测限为50μg/kg的控制点cpm值是1357。选取阴性样品,添加13种磺胺类药物标准品,添加水平分别为40μg/kg、50μg/kg和80μg/kg,测定出的cpm值与控制点cpm值1357进行比较。如样品的cpm值大于1357,则结果为阴性;如样品的cpm值小于1357,则结果为阳性。实验结果如表1。加标水平(μg/kg)阴性样品加标试验SDSM1SM2SMMSDMSQXSTZSPDSMZSTSMPSCPSIZ混标40++++++++++++++50++++++++++++++80++++++++++++++2．4实测结果分析我们应用本方法对600余份鳗鱼样品进行了磺胺类的初筛分析,筛选水平为50μg/kg,对其中筛选阳性的4份鳗鱼进行HPLC/UV的分析,均未检出磺胺类残留,可见初筛有假阳性可能。原因可能是鳗鱼生长的环境复杂如:水源、土池的土壤、饲料、用来杀菌的中药等干扰物质造成的影响。另取十份初筛阴性的样品,经HPLC/UV确认均为阴性,假阴性率为0%。3结论应用CharmII放射免疫分析方法测定鳗鱼样品的磺胺类药物残留,该检测方法可靠,灵敏度高,特异性强,快速简便,达到了日本、欧美等国磺胺类最大残留限量的检测要求,能够进行大批量样品的初筛。但是,该检测方法检测结果有假阳性的可能,因此,初筛阳性的样品必须用其它方法确证。福建省是中国最大的出口鳗鱼养殖、加工基地,年产量近七万多吨,占世界鳗鱼产量的三分之一。作为福建经济的支柱产业,鳗鱼的出口却受到了农兽药残留问题的考验。恩诺沙星、孔雀石绿残留等事件造成的损失还历历在目。CharmII放射免疫分析方法作为目前一种快捷可靠的检测手段,是目前福建大批量出口鳗鱼中磺胺类药物残留的初筛方法,值得进一步研究应用。