离子色谱在药品检验中的应用与展望

离子色谱在药品检验中的应用与展望山东省药品检验所化学药品科凌霄2010年10月25日离子型物质:在水溶液中电离，具有+或–电荷的元素阴离子：Cl-，NO2-，SO42-,CrO42-阳离子：Na+，NH4+，Ca2+，Fe3+，Mg2+离子色谱---利用色谱技术测定离子型物质的方法•20世纪40年代•20世纪60年代末•Novelionexchangechromatographicmethodusingconductimetricdetection•------HamishSmall,et.al.•Anal.Chem.,1975,47(11),1801-•《中国药典》2010年版二部附录ⅤJ内容•1.离子色谱的分离方式及机理•2.流动相•3.抑制器•4.检测器•5.离子色谱在医药及药检领域的应用离子排斥色谱（HPIEC）：无机弱酸和有机酸、醇、醛、氨基酸和糖类的分离离子对色谱(MPIC)：分离金属络和物和表面活性阳离子/阴离子高效离子交换色谱（HPIC）：亲水性阴、阳离子的分离分离的方式ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－TemporalcourseＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋离子交换分离过程分离阴离子Column：IonPacAG12A/AS12AEluent：2.7mMNa2CO30.3mMNaHCO3Flowrate：1.2mL/minDetection：Conductivity(ASRSRecyclemode)0246810121416Retentiontime(min)08mSF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-影响离子保留的因素•离子色谱法中用分配系数（指在固定相和流动相中的浓度比）来描述离子的色谱保留行为，不同离子分配系数的差异是色谱分离的基础。•影响因素有流动相流速、分离柱长度、柱温、固定相性质、流动相的种类与浓度、流动相的pH等。离子排斥色谱法的分离假说Donnan排斥作用吸附空间排阻ＳＯ３－Ｈ＋ＣＯＯ－Ｈ＋ＳＯ３－ＳＯ３－Ｈ＋ＳＯ３－Ｈ＋ＳＯ３－Ｈ＋ＣＯＯ－Ｈ＋ＣＯＯ－Ｈ＋Ｈ２ＯＨ２ＯＨ２ＯＨ２ＯＨ２ＯＨ２ＯDonnanmembraneＨ＋Ｃｌ－２Ｈ＋（ＣＯＯ－）２（ＣＯＯＨ）２ＳＯ３－Ｈ＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＯＯ－ＣＨ３ＣＯＯＨ固定相流动相离子排斥分离机理Column：IonPacICEAS1Eluent：0.4mMOctonesulfonicacidFlowrate：1.0mL/minSuppressor：AMMS-ICEⅡRegeneratorliquid：5mMTBAOH／50mMH3BO3Detection：Conductivity离子排斥法分离有机酸20100保留时间(min)0µS5123451.甲酸2.乙酸3.丙酸4.丁酸5.戊酸离子对的分离机理1.生成离子对－待测离子与离子对试剂生成中性“离子对”分布于固定相与流动相之间，其分离类似传统的反相分离2.动态离子交换－离子对试剂的疏水部分吸附于固定相形成动态的离子交换表面，其分离机理类似于离子交换。3.离子间相互作用－除包括以上两种分离机理和固定相表面双电层结构的分离机理。MobilephaseTBAOH／ACN／H2OSampleY+X-Ｈ２ＯＨ２Ｏ固定相TBA+OH-Y+X-Y+X-(TBA+X-)(TBA+X-)(TBA+X-)(TBA+X-)TBA+OH-ACNACNACNACNACNACNACNTBA+OH-TBA+OH-疏水相亲水相离子对分离机理Y+OH-Column:IonPacNS1、NG1Eluent:2mMTBAOH,24%～48%CANgradientin10minFlowrate:1.0mL/minDetection:Conductivity(suppressortype)（ASRSMPICMode）Regenerator:10mNH2SO41.Methanesulfonicacid5.0μg/mL(ppm)2.1-Propanesulfonicacid8.63.1-Butanesulfonicacid8.74.1-Hexanesulfonicacid8.85.1-Heptanesulfonicacid8.96.1-Octanesulfonicacid8.97.1-Decanesulfonicacid9.10Retentiontime(min)12168µS0.0416234578.0反相离子对分离测定离子色谱固定相—分离的核心抓住基础注重积累关注发展离子色谱流动相选择的条件•有一定的洗脱能力；•化学、物理性质稳定；•与被测离子有一定的性质差异；•对检测器响应值尽可能小离子色谱使用的水与试剂•纯度尽可能高高纯水：电阻率≧17MΩ、0.22μm滤膜过滤：流动相脱气（在线氦气脱气或超声、减压过滤离线脱气）冷冻方式脱气？？试剂：尽可能使用优级纯：配标准的试剂应预先干燥抑制型阴离子色谱的典型流动相四硼酸钠(Na2B4O7)硼酸(H3BO3)氢氧根(NaOH)碳酸氢根(NaHCO3)碳酸根(Na2CO3)通常，作为流动相使用的化合物在水溶液中的pH大于8时为阴离子，pH在5-8之间为中性分子，其阴离子对固定相亲合力.与待测离子相近，这类化合物可作阴离子分析的流动相。流动相强度阳离子交换流动相的选择•流动相有足够的电离，以提供阳离子的脱离；•多价阳离子有更大的洗脱能力；•洗脱离子半径越大，洗脱能力越强；•与被测离子有足够大的电导差异；对抑制电导法，抑制后流动相背景电导足够小•流动相的背景较小较理想；酸或对应的弱碱•对于有机胺类，加入有机改进剂，会减少保留时间并且改善峰形阳离子交换所用的流动相•盐酸•硝酸•硫酸•甲磺酸•吡啶－2,6－二羧酸离子排斥色谱常用流动相•主要作用:改变溶液的pH值,控制有机酸的离解•最简单的是去离子水，•对有机酸的分析，常用矿物酸，如HCl，H2SO4，HNO3等。•Ag+型阳离子交换剂作抑制器填料:HCl•若用直接UV检测:H2SO4混合流动相•流动相中添加有机溶剂（疏水性离子的吸附、分配）•强流动相＋弱流动相（淋洗强度的准确调节）•流动相中有目的地添加特殊试剂（如：酒石酸＋冠醚，用于钾钠分离）调节流动相强度和极性色谱柱、流动相的温度流动相的浓度与组成流动相的流速流动相中的杂质影响色谱分析的各种条件一价离子快速洗脱二价离子较慢洗脱温度增加02468101214202530354045Temp.℃）Retentiontime(min)F-Cl-NO2-Br-NO3-HPO42-SO42-色谱柱、流动相的温度流动相浓度vs.保留时间0481216208mM9mM10mM11mM12mM13mM浓度（ＭＳＡ）Retentiontime(min)Na+NH4+K+Mg2+Ca2+流动相的组成vs.保留时间04812162000.110.220.33Comp.ratio(NaHCO3/Na2CO3)Retentiontime(min)F-Cl-NO2-Br-NO3-HPO42-SO42-100µS0%ACN20%ACN50%ACN12345671234567010Retentiontime(min)12,34567101000µSµS1.F-2.Cl-3.NO2-4.Br-5.NO3-6.HPO42-7.SO42-流动相中有机溶剂的影响ExAS4A-SCcolumn流动相的流速VS.面积0200040006000800010000120000.511.52Flowrate（mL/min）AreaF-Cl-NO2-Br-NO3-HPO42-SO42-流速增加各组份的峰面积减少流动相中杂质的影响正常流动相流动相被Cl沾污-15uSCl-:0.5μg/ml背景电导：13μS0.005.0010.00-42uSRetentiontime(min)背景电导：56μS流动相泵色谱柱检测器泵液分离检测记录F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-进样阀抑制器检测池进样离子色谱的基本流程图废液NaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity抑制器的作用流动相四元梯度泵保护柱离子色谱柱抑制器电导检测器安装在电导池之前提高待测离子的电导率：提高灵敏度Na+,Cl-H+,Cl-降低背景电导(流动相):减少噪音Na+,HCO3-H2CO3Na+,OH-H2O抑制器检测器检测方法原理应用范围电导法电导阴、阳离子和有机酸安培法直流安培检测器测量电活性分子在工作电极表面氧化或还原反应时所产生电流变化的检测器碘离子、亚硫酸根、氰化物、硫化物、酚类、儿茶酚胺类积分安培检测器伯胺、仲胺、叔胺、硫化物、硫醇、氨基酸脉冲安培检测器伯胺、仲胺、叔胺、醇、乙二醇、醛、糖类紫外/可见光检测紫外/可见光吸收亚硝酸根离子、硝酸根离子及其他具有强紫外吸收成分的测定，柱后衍生常用于分离分析过渡金属离子和镧系金属等荧光（结合柱后衍生）激发和发射铵、氨基酸样品处理•过滤–样品中除去颗粒物–用0.45μm或0.22μm滤膜–用高纯水冲洗滤膜，以减少沾污•稀释–待测物浓度较高时，应预先稀释.–降低干扰物的浓度.•去除干扰物–预处理柱，超滤–固相萃取・液相萃取・离心・盐析–在线柱处理在药检领域的应用•《中国药典》2010年版新增品种•糖类分析•氨基酸分析新增品种•帕米磷酸二钠•氯膦酸二钠帕米磷酸二钠PamidronateDisodium(PamidronateDisodiumPentahydrate)H2NPOHONaOHOPONaOHO,5H2O帕米磷酸二钠《中国药典》2010年版USP32(原料和注射用)BP2008(原料)EP6.0(原料)有关物质无高效液相色谱法阴离子交换树脂(色谱柱),以0.0188%甲酸溶液,80g/L氢氧化钠溶液调pH值至3.5为流动相,折光检测器高效液相色谱法阴离子交换树脂(色谱柱),以0.02%甲酸溶液,80g/L氢氧化钠溶液调pH值至3.5为流动相,折光检测器高效液相色谱法阴离子交换树脂(色谱柱),以0.02%甲酸溶液,80g/L氢氧化钠溶液调pH值至3.5为流动相,折光检测器含量离子色谱法阴离子交换色谱柱，以3mmol/L草酸为流动相，流速1.2ml/min,电导检测器高效液相色谱法阴离子交换树脂(色谱柱),以0.0188%甲酸溶液,80g/L氢氧化钠溶液调pH值至3.5为流动相,折光检测器电位滴定法电位滴定法氯膦酸二钠ClodronateDisodium(ClodronateDisodiumTetrahydrate),4H2OPOHOPOOHONaNaOClCl氯膦酸二钠WS1-（X-061）2002Z《中国药典》2010年版EP(原料)有关物质无离子色谱法阴离子交换色谱柱,以水为流动相A,以0.1mol/L氢氧化钾溶液为流动相B,梯度洗脱电导检测器离子色谱法阴离子交换色谱柱,以0.21g/L氢氧化钠溶液为流动相A,以4.2g/L氢氧化钠溶液为流动相B,梯